يستخدم مختبرنا Drosophila melanogaster لتحديد وتوصيف الجينات والمسارات التي تنظم وظيفة الميتوكوندريا أثناء التطور وداء التوازن الفسيولوجي. يستخدم البروتوكول المعروض هنا التصوير الحي مع إضافة بيروكسيد الهيدروجين لتصور آثار الضرر التأكسدي على توطين وديناميات الهياكل دون الخلوية في المبيض Drosophila الكبار. نحن كثيرا ما نستخدم بروتوكولات التصوير لدراسة كيفية تغيير الطفرات توطين الميتوكوندريا الطبيعي والحركة في الخلايا الجرثومية الأنثوية.
في سياق دراساتنا وجدنا أن الإجهاد الذي أدخله تشريح أو غيرها من الضغوطات الخلية كان لها تأثير عميق على توطين الميتوكوندريا. كعنصر تحكم لتحديد ما إذا كان الإجهاد العام ، بدلا من العلاج التجريبي ، هو سبب أي تغييرات في توطين أو سلوك الهياكل دون الخلوية. لقد طورنا هذا البروتوكول لإدخال إجهاد التحكم باستخدام بيروكسيد الهيدروجين.
في هذا الفيديو، سوف نظهر كيف أن الضرر التأكسدي الناجم عن بيروكسيد الهيدروجين يغير توزيع الميتوكوندريا وريبونوكليوبروتين كلو. وسائل الإعلام الأنسب لهذه التقنية التصوير الحي يحتوي على وسائل الإعلام Drosophila شنايدر تحتوي على 15٪ الحرارة المعطل مصل البقر الجنين، 0.6 X القلم ستريب، و 200 ميكروغرام لكل الأنسولين البقري ميكروليتر، ويشار إليها فيما بعد وسائل الإعلام شنايدر كاملة. إن إجراء التحضير الإعلامي في ظل ظروف معقمة سيضمن عدم تلوثه.
خلط محتويات جيدا وتخزينها بين عشية وضحاها في أربع درجات. الأنسولين لا يذوب تماما في وسائل الإعلام شنايدر كاملة وسوف تلاحظ تسوية عجل في الجزء السفلي من الأنبوب. جعل aliquots ، والتأكد من ترك هذا التعجيل لأنها سوف تتداخل مع التصوير.
ويمكن استخدام هذا الحل لمدة شهر واحد إذا تم تخزينها في aliquots في أربع درجات. لتصوير الخلايا الجرثومية الأنثوية الأمثل، قم أولا بإعداد قارورة تحتوي على داب من عجينة الخميرة الرطبة التي هي اتساق زبدة الفول السوداني. وهذا يضمن تغذية الإناث بشكل جيد وسوف تنتج جميع مراحل نمو الجريب للتصوير.
للذباب صحية على النحو الأمثل، وجمع صفر إلى يوم واحد الإناث القديمة ونقل مع الذكور في قارورة طعام ذبابة تحتوي على عجينة الخميرة الرطب. تأكد من أن الذباب النائم لا يتصل بلصق الخميرة حيث يمكنه التمسك به. إطعام الذباب ثلاثة إلى سبعة أيام، وتغيير عجينة الخميرة يوميا.
تأكد من أن عجينة الخميرة تتصل بالطعام الذبابي ، حتى لا تجف. للحث على الضرر التأكسدي، وسوف نستخدم محلول الأسهم من بيروكسيد الهيدروجين 30٪، وتصور الميتوكوندريا، وسوف نستخدم محلول الأسهم من 100 ملليمولار TMRE. من المهم إعداد حلول الوسائط طازجة لأن بيروكسيد الهيدروجين عرضة للأكسدة وتحلل TMRE بمرور الوقت.
الحق قبل تشريح، في وسائل الإعلام شنايدر كاملة، وإعداد aliquot جديدة من اثنين من بيروكسيد الهيدروجين ميكرومولار، وaliquot الطازجة من 46 نانومولار TMRE، وaliquot جديدة من 46 نانومولار TMRE بالإضافة إلى اثنين من بيروكسيد الهيدروجين ميكرومولار. لتشريح المبيض ستحتاج إلى زوجين من ملقط غرامة وزوج من الإبر التنغستن شحذ كهربائيا. لتشريح المبيضين ملء زجاج ساعة مع وسائل الإعلام شنايدر كاملة التي تم تسخينها لدرجة حرارة الغرفة، ثم وضع ذبابة واحدة في وسائل الإعلام باستخدام ملقط.
فهم بلطف ذبابة الصدر باستخدام زوج واحد من ملقط غرامة. مع ملقط أخرى، فهم الخلفي وسحب بلطف لإزالة المبيضين. قم بإزالة أي كد أو نسيج دخيل، ثم قم بنقل المبيض إلى بئر جديد يحتوي على وسائط جديدة.
يجب أن يكون المبيضان لا يزالان يتحركان من غمد العضلات المحيط. باستخدام الإبر التنغستن شحذ، ندف بلطف بعيدا ovarioles، مع الحرص على إزالة غمد العضلات المحيطة بها. إذا لم تتم إزالة غمد العضلات ، كما هو موضح هنا ، فإن ovaria ترتعش ، مما يسبب مشاكل في الحصول على الصورة.
مرة واحدة وقد تم تشريح ovarioles نظيفة، ونقلها في قطرة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى طبق MatTek إذا تصور هياكل وصفت محليا. نقل ovarioles في قطرة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام TMRE إلى طبق MatTek إذا تصور الميتوكوندريا المسمى مع TMRE. سوف تغرق البويضة إلى أسفل القطيرات.
من المهم ممارسة التشريح من أجل البدء في تصوير الأنسجة في أسرع وقت ممكن. بمجرد تركيب الovarioles ، ضع الطبق على المجهر المقلوب والحصول على صور ثابتة أو مقاطع فيديو قصيرة كسجل لظروف ما قبل المعالجة. وبمجرد الانتهاء من ذلك، وقفة التصوير الحي، وإزالة الغطاء، وإضافة بعناية 100 ميكرولتر من اثنين من بيروكسيد الهيدروجين ميكرومولار إعداد الحل.
تجنب كسر سطح قطرة الوسائط الموجودة أو إضافة الحل بسرعة كبيرة ، حتى لا تحل محل البويضة التي تقع في الأسفل. استبدال غطاء الطبق، ونقل وإعادة تركيز ovariole المطلوب، واستئناف التصوير. الحرص على استئناف التصوير في أسرع وقت ممكن، حيث أن العلاج التجريبي حساس للوقت.
تظهر هنا صور ثابتة من فيلم، تم التقاطها بعد معالجة بيروكسيد الهيدروجين. تنتشر الميتوكوندريا والخلايا الجرثومية الأنثوية في جميع أنحاء السيتوبلازم عندما يتم تغذية الذباب بشكل جيد وصحي. بعد إضافة بيروكسيد الهيدروجين ، يتسبب الضرر التأكسدي في تكتل الميتوكوندريا ، والتي يمكن رؤيتها بسرعة 10 دقائق بعد العلاج.
بعد 20 دقيقة ، يسبب الضرر احتمال تبدد غشاء الميتوكوندريا. وهكذا، فإن غالبية الميتوكوندريا تتلاشى. في هذا الفيلم الحي للعملية ، يمكن رؤية الميتوكوندريا تتجمع بسرعة وغالبية الميتوكوندريا تتلاشى في نهاية المطاف.
النبض وامض في السيتوبلازم، لا سيما في الخلايا بصيلات المحيطة بها، ويبدو سمة من سمات إضافة TMRE. كما ذكرنا من قبل ، يجب أن يتم التصوير بسرعة بعد إضافة بيروكسيد الهيدروجين. كما هو موضح هنا ، إذا انقضى الكثير من الوقت ، يتم فقدان إمكانات غشاء الميتوكوندريا بالفعل ويتبدد وضع العلامات TMRE ، مما يجعل البيانات غير قابلة للتفسير.
في هذه الصور الثابتة الفيديو، GFP المسمى محليا جزيئات كلو قوية ووفيرة في الجرثومة من الإناث تغذية جيدة. بعد إضافة بيروكسيد الهيدروجين ، تتفرق جزيئات Clu في غضون 10 دقائق. ويتجلى ذلك في الفيديو المصاحب.
بعد إضافة بيروكسيد الهيدروجين، جزيئات النعيم كلو تفريق بسرعة. لقد وجدنا أن هذا البروتوكول أداة مفيدة لضمان التصوير الدقيق لتوطين البرية من نوع الميتوكوندريا وجسيمات النعيم كلو في الخلايا الجرثومية الإناث Drosophila. يجب أن ينطبق هذا البروتوكول على مجموعة واسعة من دراسات التصوير الحي ويمكن استخدامه لعلاج الأنسجة قبل التثبيت أيضا.
أهم الخطوات هي عزل ovarioles خالية من غمد العضلات، لإضافة بلطف بيروكسيد الهيدروجين، حتى لا إزاحة ovarioles، وصورة بسرعة بعد إضافة بيروكسيد الهيدروجين. نأمل أن تجد هذا عنصر تحكم مفيد للتصوير الحي مجموعة متنوعة من الهياكل دون الخلوية. أشكركم على مشاهدة وحظا سعيدا مع التجارب الخاصة بك.
