Unser Labor verwendet Drosophila melanogaster, um Gene und Wege zu identifizieren und zu charakterisieren, die die mitochondriale Funktion während der Entwicklung und physiologischen Homöostase regulieren. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet Live-Bildgebung mit Zusatz von Wasserstoffperoxid, um die Auswirkungen oxidativer Schäden auf die Lokalisation und Dynamik subzellulärer Strukturen im erwachsenen Drosophila-Ovarial zu visualisieren. Wir verwenden häufig bildgebende Protokolle, um zu untersuchen, wie Mutationen die normale mitochondriale Lokalisation und Bewegung in weiblichen Keimzellen verändern.
Im Laufe unserer Studien fanden wir heraus, dass Stress, der durch Sezieren oder andere Zellstressoren eingeführt wurde, einen tiefen Einfluss auf die mitochondriale Lokalisation hatte. Als Kontrolle, um zu identifizieren, ob allgemeine Spannung im Gegensatz zur experimentellen Behandlung die Ursache für Änderungen an der Lokalisierung oder dem Verhalten subzellulärer Strukturen ist. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um Kontrollstress mit Wasserstoffperoxid einzuführen.
In diesem Video zeigen wir, wie Wasserstoffperoxid-induzierte oxidative Schäden die Verteilung von Mitochondrien und dem Ribonukleoprotein Clu verändern. Das für diese Live-Bildgebungstechnik am besten geeignete Medium enthielt Schneiders Drosophila-Medien, die 15% inaktiviertes fetales Rinderserum, 0,6 X Pen-Strep und 200 Mikrogramm pro Mikroliter Rinderinsulin enthielten, im Folgenden als vollständiges Schneider-Medium bezeichnet. Die Durchführung der Medienzubereitung unter sterilen Bedingungen stellt sicher, dass sie nicht kontaminiert wird.
Mischen Sie den Inhalt gut und lagern Sie über Nacht bei vier Grad. Insulin löst sich in den gesamten Medien von Schneider nicht vollständig auf und Sie werden feststellen, dass sich ein Niederschlag im Boden des Rohres niederlässt. Machen Sie Aliquots, sicher sein, diesen Niederschlag zu verlassen, da es die Bildgebung stören wird.
Diese Lösung kann für einen Monat verwendet werden, wenn in Aliquots bei vier Grad gelagert. Für eine optimale weibliche Keimzellbildgebung bereiten Sie zunächst eine Durchstechflasche vor, die einen Tupfer mit nasser Hefepaste enthält, die die Konsistenz von Erdnussbutter ist. Dies stellt sicher, dass die Weibchen gut gefüttert werden und alle Follikelentwicklungsstadien für die Bildgebung produzieren.
Für optimal gesunde Fliegen, sammeln Sie null bis ein Tag alte Weibchen und transferieren mit Männchen in eine Fliegenfutter-Fläschchen mit nasser Hefepaste. Stellen Sie sicher, dass die schlafenden Fliegen die Hefepaste nicht kontaktieren, da sie daran kleben können. Füttern Sie die Fliegen drei bis sieben Tage, ändern Sie die Hefepaste täglich.
Stellen Sie sicher, dass die Hefepaste mit dem Fliegenfutter in Kontakt kommt, damit sie nicht austrocknet. Um oxidative Schäden zu verursachen, verwenden wir eine Stammlösung von 30% Wasserstoffperoxid und um Mitochondrien zu visualisieren, verwenden wir eine Lagerlösung von 100 Millimolar TMRE. Es ist wichtig, die Medienlösungen frisch vorzubereiten, da Wasserstoffperoxid anfällig für Oxidation ist und TMRE im Laufe der Zeit abgebaut wird.
Kurz vor der Zerlegung, in vollständigen Schneider Medien, bereiten Sie ein frisches Aliquot aus zwei mikromolaren Wasserstoffperoxid, ein frisches Aliquot von 46 Nanomolar TMRE, und ein frisches Aliquot von 46 nanomolar TMRE plus zwei mikromolareWasserstoffperoxid. Für Die Eierstocksektion benötigen Sie zwei Paar feine Zangen und ein Paar elektrolytisch geschärfte Wolframnadeln. Um die Eierstöcke zu sezieren, füllen Sie ein Uhrenglas mit kompletten Schneiders Medien, die auf Raumtemperatur erwärmt wurden, und legen Sie dann eine einzelne Fliege mit Zangen in die Medien.
Greifen Sie die Fliege vorsichtig am Thorax mit einem Paar feiner Zange. Mit den anderen Zangen, greifen Sie die hintere und ziehen Sie sanft, um die Eierstöcke zu entfernen. Entfernen Sie alle fremden Nagelhaut oder Gewebe, dann übertragen Sie den Eierstock auf einen neuen Brunnen mit frischen Medien.
Die Eierstöcke sollten sich immer noch von der umgebenden Muskelscheide bewegen. Mit den geschärften Wolframnadeln, sanft necken die Ovarioles, pflege die umgebende Muskelscheide zu entfernen. Wenn der Muskelmantel nicht entfernt wird, wie hier gezeigt, wird die Ovaria zucken, was Probleme mit der Bildaufnahme verursacht.
Sobald die Ovariolen sauber seziert wurden, übertragen Sie sie in einem 100-Mikroliter-Tropfen Medien auf eine MatTek-Schale, wenn sie endogen beschriftete Strukturen visualisieren. Übertragen Sie die Ovariolen in einem 100-Mikroliter-Tropfen TMRE-Medien auf eine MatTek-Schale, wenn Sie Mitochondrien mit TMRE beschriftet visualisieren. Die Ovariolen sinken auf den Boden des Tröpfchens.
Es ist wichtig, Sezieren zu üben, um so schnell wie möglich mit der Bildgebung des Gewebes zu beginnen. Sobald die Ovariolen montiert sind, legen Sie die Schale auf das invertierte Mikroskop und erfassen Sie Standbilder oder kurze Videos als Aufzeichnung der Vorbehandlungsbedingungen. Sobald dies geschehen ist, halten Sie die Live-Bildgebung an, entfernen Sie den Deckel und fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter der beiden mikromolaren Wasserstoffperoxid-vorbereiteten Lösung hinzu.
Vermeiden Sie es, die Oberfläche des vorhandenen Medientröpfchens zu brechen oder die Lösung zu schnell hinzuzufügen, um die auf dem Boden ruhenden Ovariolen nicht zu verdrängen. Ersetzen Sie die Tellerabdeckung, verschieben und neu fokussieren die gewünschte ovariole, und setzen Sie die Bildgebung. Achten Sie darauf, die Bildgebung so schnell wie möglich wieder aufzunehmen, da die experimentelle Behandlung zeitempfindlich ist.
Hier sind Standbilder aus einem Film zu sehen, der nach der Wasserstoffperoxidbehandlung aufgenommen wurde. Mitochondrien und weibliche Keimzellen werden im gesamten Zytoplasma verteilt, wenn die Fliegen gut gefüttert und gesund sind. Nach Wasserstoffperoxidzugabe verursacht die oxidative Schädigung Mitochondrien zu Klumpen, die so schnell wie 10 Minuten nach der Behandlung gesehen werden können.
Nach 20 Minuten führt der Schaden dazu, dass sich das mitochondriale Membranpotenzial ableitet. So verblasst die Mehrheit der Mitochondrien. In diesem Live-Film des Prozesses, Mitochondrien kann schnell klumpen und die Mehrheit der Mitochondrien schließlich verblassen gesehen werden.
Das pulsierende Blinken im Zytoplasma, insbesondere in den umgebenden Follikelzellen, erscheint charakteristisch für die TMRE-Zugabe. Wie bereits erwähnt, muss die Bildgebung schnell nach Wasserstoffperoxid-Zugabe erfolgen. Wie hier gezeigt, ist bei zu viel Zeit bereits das mitochondriale Membranpotential verloren und die TMRE-Beschriftung löst sich auf, wodurch die Daten nicht interpretierbar werden.
In diesen Video-Standbildern sind GFP-endogen markierte Clu-Partikel robust und reichlich im Keimplasma gut gefütterter Weibchen. Nach Wasserstoffperoxidzugabe dispergieren sich Clu-Partikel innerhalb von 10 Minuten. Das zeigt das begleitende Video.
Nach Wasserstoffperoxidzugabe zerstreuen sich die Clu-Glückseligkeitspartikel schnell. Wir haben festgestellt, dass dieses Protokoll ein nützliches Werkzeug ist, um eine genaue Abbildung der Wildtyp-Lokalisation von Mitochondrien und Clu-Glückseligkeitspartikeln in Drosophila-weiblichen Keimzellen zu gewährleisten. Dieses Protokoll sollte für eine breite Palette von Live-Imaging-Studien gelten und könnte auch zur Behandlung von Geweben vor der Fixierung verwendet werden.
Die wichtigsten Schritte sind, Ovariolen frei von der Muskelhülle zu isolieren, das Wasserstoffperoxid sanft hinzuzufügen, um die Ovariolen nicht zu vertreiben, und schnell nach Wasserstoffperoxidzugabe abzubilden. Wir hoffen, dass Sie dies eine nützliche Steuerung für die Live-Bildgebung einer Vielzahl von subzellulären Strukturen finden. Vielen Dank für Das Zuschauen und viel Glück mit Ihren Experimenten.
