우리의 실험실은 Drosophila 멜라노가스터를 사용하여 발달 과 생리 적 항상성 동안 미토콘드리아 기능을 조절하는 유전자와 경로를 식별하고 특성화합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 과산화수소의 추가와 함께 살아있는 화상 진찰을 사용하여 성인 Drosophila 난소에 있는 세포극 구조물의 현지화 그리고 역학에 산화 손상의 효력을 시각화합니다. 우리는 돌연변이가 여성 세균 세포에 있는 일반적인 미토콘드리아 현지화 및 운동을 어떻게 바꾸는지 연구하기 위하여 화상 진찰 프로토콜을 자주 이용합니다.
연구 과정에서 우리는 해부 또는 다른 세포 스트레스에 의해 도입 된 스트레스가 미토콘드리아 국소화에 지대한 영향을 미친다는 것을 발견했습니다. 실험적 치료와 는 달리 일반적인 스트레스가 세포 외 구조의 국소화 또는 행동에 대한 변화의 원인인지 여부를 식별하는 대조군으로서. 우리는 과산화수소를 사용하여 제어 응력을 도입하기 위해이 프로토콜을 개발했습니다.
이 비디오에서는 과산화수소로 인한 산화 손상이 미토콘드리아와 리보뉴클레오단백질 클루의 분포를 어떻게 변화시키는지 시연합니다. 이 라이브 이미징 기술에 가장 적합한 미디어는 슈나이더의 Drosophila 미디어포함 15% 열 불활성화 태아 소 소 혈청, 0.6 X 펜-스트렙, 그리고 200 마이크로 리터 소 인슐린 당 마이크로 그램, 이하 완전한 슈나이더의 미디어라고. 멸균 조건하에서 미디어 준비를 수행하면 오염되지 않습니다.
내용내용을 잘 섞고 하룻밤 동안 4도에 보관하십시오. 인슐린은 완전한 슈나이더의 미디어에 완전히 녹지 않으며 튜브 의 바닥에 침전소정착을 알 수 있습니다. 알리인용을 만들고, 이미징을 방해할 수 있으므로 이 침전을 남깁니다.
이 용액은 알리쿼트에 4도에 저장되는 경우 1개월 동안 사용할 수 있습니다. 최적의 여성 세균 세포 이미징을 위해 먼저 땅콩 버터의 일관성인 젖은 효모 페이스트를 함유한 바이알을 준비하십시오. 이것은 여성이 잘 공급되고 화상 진찰을 위한 모든 여포 발달 단계를 생성할 것이라는 점을 보장합니다.
최적으로 건강한 파리의 경우, 0에서 1일 된 암컷을 모으고 수컷과 함께 젖은 효모 페이스트를 함유한 플라이 푸드 바이알로 옮기. 잠자는 파리가 효모 페이스트에 닿지 않도록 하십시오. 매일 효모 페이스트를 변경, 3 ~ 7 일 파리를 공급합니다.
효모 페이스트가 플라이 푸드와 접촉하여 건조하지 않도록 하십시오. 산화 손상을 유도하기 위해 과산화수소 30%의 스톡 솔루션을 사용하고 미토콘드리아를 시각화하여 100 밀리머 TMRE의 스톡 솔루션을 사용할 것입니다. 과산화수소는 산화에 취약하고 TMRE가 시간이 지남에 따라 저하되기 때문에 미디어 솔루션을 신선하게 준비하는 것이 중요합니다.
해부 직전, 슈나이더의 전체 매체에서 과산화수소 2개, 신선한 알리쿼트 46 나노몰러 TMRE, 46나노몰러 TMRE의 신선한 알리쿼트, 과산화수소 2개에 대한 신선한 알리쿼트를 준비한다. 난소 해부를 위해 당신은 미세 집게의 두 쌍과 전극 날카롭게 텅스텐 바늘의 쌍이 필요합니다. 난소는 실온으로 따뜻해졌던 슈나이더의 완벽한 미디어로 시계 유리를 채운 다음 집게를 사용하여 미디어에 한 번의 비행을 배치합니다.
한 쌍의 미세 한 개의 집게를 사용하여 흉부로 부드럽게 날아다릅니다. 다른 집게와 함께, 후방을 잡고 부드럽게 당기면 난소를 제거합니다. 어떤 외부 큐티클 또는 조직을 제거 한 다음 신선한 미디어를 포함하는 새로운 우물로 난소를 옮는다.
난소는 여전히 주변 근육 칼집에서 이동해야 한다. 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여, 부드럽게 주변 근육 칼집을 제거하는 주의, 오바리오를 따로 애타게. 여기에서 설명한 바와 같이 근육 칼집이 제거되지 않으면, 바리아는 트위치하여 이미지 수집에 문제를 일으킵니다.
일단 바실리올이 깨끗하게 해부되면 내인성으로 표시된 구조를 시각화하면 100 마이크로리터 의 미디어 드롭을 MatTek 접시에 옮기습니다. TMRE로 표시된 미토콘드리아를 시각화하면 100 마이크로리터 TMRE 매체의 소바리오를 MatTek 접시에 옮기습니다. 악보는 물방울의 바닥으로 가라 앉을 것입니다.
가능한 한 빨리 조직을 이미징하기 위해 해부를 연습하는 것이 중요합니다. 바오리올이 장착되면, 반전 된 현미경에 접시를 배치하고 전처리 조건의 기록으로 정지 이미지 또는 간단한 비디오를 수집합니다. 이 작업이 완료되면 라이브 이미징을 일시 중지하고 뚜껑을 제거하고 과산화수소 제조 된 두 마이크로 몰러 수소의 마이크로 리터 100 마이크로 리터를 조심스럽게 추가하십시오.
하단에 있는 바실리올을 대체하지 않도록 기존 미디어 액적의 표면을 깨뜨리거나 솔루션을 너무 빨리 추가하지 마십시오. 접시 커버를 교체하고, 원하는 바오리올을 재배치하고 재배치하고, 이미징을 다시 시작합니다. 실험 치료가 시간에 민감하기 때문에 가능한 한 빨리 이미징을 재개하십시오.
여기에 영화와 과산화수소 후 처리를 찍은 스틸 이미지가 표시됩니다. 미토콘드리아와 암컷 세균 세포는 파리가 잘 공급되고 건강할 때 세포질 전체에 분산됩니다. 과산화수소 첨가 후, 산화 손상으로 인해 미토콘드리아가 덩어리로 변하며, 이는 치료 후 10분만큼 빨리 볼 수 있습니다.
20 분 후, 손상은 미토콘드리아 막 잠재력이 소멸됩니다. 따라서, 미토콘드리아의 대부분은 퇴색한다. 이 과정의 라이브 영화에서 미토콘드리아는 빠르게 뭉쳐 있고 미토콘드리아의 대부분은 궁극적으로 퇴색하는 것을 볼 수 있습니다.
세포질에서 깜박이는 맥동, 특히 주변 여포 세포에서, TMRE 추가의 특성을 나타납니다. 앞서 언급했듯이, 이미징은 과산화수소 첨가 후 신속하게 진행되어야 합니다. 여기에 표시된 바와 같이, 너무 많은 시간이 경과하면 미토콘드리아 막 전위가 이미 손실되고 TMRE 라벨이 소멸되어 데이터를 해석할 수 없게 만듭니다.
이 비디오 스틸 이미지에서, GFP 내인성 으로 표시 된 Clu 입자는 견고하 고 잘 공급 된 여성의 세균에 풍부. 과산화수소가 첨가된 후, 클루 입자는 10분 이내에 분산됩니다. 이는 함께 제공되는 비디오에서 보여 지습니다.
과산화수소가 첨가된 후, Clu 블리스 입자는 빠르게 분산됩니다. 우리는 Drosophila 여성 세균 세포에 있는 미토콘드리아와 Clu bliss 입자의 야생 형 현지화의 정확한 화상 진찰을 지키기 위하여 이 프로토콜이 유용한 공구일 것을 것을을 발견했습니다. 이 프로토콜은 광범위한 라이브 이미징 연구에 적용 가능해야 하며 고정하기 전에 조직을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.
가장 중요한 단계는 근육 칼집이없는 혈관을 분리하고, 과산화수소를 부드럽게 첨가하여, 바오리올을 빼내지 않도록 하고, 과산화수소 첨가 후 신속하게 이미지화하는 것입니다. 우리는 당신이 라이브 이미징에 대한 유용한 제어를 찾을 수 있기를 바랍니다 세포 전 형 구조의 다양한. 당신의 실험으로 보고 행운을 주셔서 감사합니다.
