患者外周血单核细胞中人心肌细胞的生成和扩增

这是全面的方案设施，原始增强生成，并使用患者特异性，从外周血单核细胞中培养物。这种策略是可重复的，易于遵循，特别是对于初学者。并且不需要，特别擅长干细胞民谣或心血管医学。

我们的方案可用于从单次抽血中生成患者特定的心肌细胞，可用于模拟心血管疾病和测试新药的心脏毒性。该协议需要长时间致力于干细胞重编程维持和定向分化。但是，您真的很欣赏自己的努力。

当你在盘子里看到心肌细胞跳动时。当人iPSC菌落达到90%汇合度以上时，用3毫升DPBS冲洗每个孔，然后在37摄氏度下用每孔DPBS中的1毫升0.5毫摩尔EDTA处理细胞。五到八分钟后，向每个孔中加入一毫升iPSC传代培养基，并手动移走细胞。

将600至900微升的细胞转移到具有基底膜包覆的六孔板的单个孔中，以便在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育过夜。然后每天用两毫升完整的E8培养基刷新培养物，持续三到四天。当培养物达到汇合时，用两毫升心肌细胞分化培养基代替培养基，每孔两个。

第二天，用两毫升心肌细胞分化培养基一代替上清液。第三天，用两毫升心肌细胞分化培养基三代替上清液。第五天。

用2毫升心肌细胞分化培养基1代替上清液。在第7天至第10天，用2毫升心肌细胞分化培养基4代替上清液。在第11天和第13天。

当观察到收缩细胞时，用两毫升心肌细胞分化培养基五代替上清液。第15、17、19和21天。用2毫升心肌细胞分化培养基四取代上清液。

每7天用全血培养基预培养后，PBMC变大，可见细胞核和细胞质表明它们已准备好用仙台病毒重编程因子转染。在介绍完成E8培养基后。完全重编程的细胞将附着并开始形成菌落。

经过四到五次传代后，高纯度的iPSC集落将从重编程的细胞中形成，观察到很少的分化细胞。在这个阶段，大多数细胞是OCT4和NANOG阳性，表明它们的多重性。心肌细胞跳动通常在分化 12 天后观察到。

葡萄糖匮乏和 iPSC 重镀后，心肌细胞出现自发跳动和肌节结构对齐，伴有插插的心脏肌钙蛋白 T 和 α 肌动蛋白表达。菌落保持其纯度，如其肌钙蛋白T表达所证明的那样。虽然与成年心肌细胞相比，iPSC心肌细胞相对不成熟。

它们表现出通过批发贴片，钳子测量的心室和心房样动作电位。心室心肌细胞表达肌球蛋白轻链二，而心房iPSC心肌细胞以NR2F2表达为标志。Wnt活化刺激细胞分裂并促进细胞周期调节剂的表达。

有趣的是，与对照组相比，Wnt激活还诱导早期iPSC心肌细胞在两次传代中强劲增殖，尽管这种增殖能力会随着时间的推移而减弱。在引入iPSC重编程载体之前，确保PBMS用透明的核和细胞质扩大，因为PBM的条件对于iPSC重编程至关重要。患者特异性心肌细胞对于体外心血管疾病建模和为心脏干细胞治疗提供大量供体细胞很有价值。