Se trata de instalaciones de protocolo integrales, generación de impulsos brutos y uso de cultivos específicos del paciente a partir de células mononucleares de sangre periférica. Estas tácticas son reproducibles y fáciles de seguir, especialmente para principiantes. Y no requiere, especial experiencia en baladas de células madre o medicina cardiovascular.
Nuestro protocolo se puede utilizar para generar cardiomiocitos específicos del paciente a partir de una sola extracción de sangre que se puede utilizar para modelar enfermedades cardiovasculares y probar la toxicidad cardíaca de nuevos medicamentos. Este protocolo requiere un compromiso de mucho tiempo para el mantenimiento de la reprogramación de células madre y la diferenciación dirigida. Sin embargo, realmente aprecias tus esfuerzos.
Cuando veas batir cardiomiocitos en el plato. Cuando las colonias humanas de iPSC alcancen más del 90% de confluencia, enjuague cada pozo con tres mililitros de DPBS antes de tratar las células con un mililitro de EDTA de 0,5 milimolares en DPBS por pozo a 37 grados Centígrados. Después de cinco a ocho minutos, agregue un mililitro de medio de paso iPSC a cada pozo y desaloje manualmente las células.
Transfiera de 600 a 900 microlitros de las células a pozos individuales Que tienen una placa de seis pocillos recubierta de membrana basal para una incubación nocturna a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Luego refresque los cultivos con dos mililitros de medio E8 completo todos los días durante tres o cuatro días. Cuando el cultivo haya alcanzado la confluencia, reemplace el medio con dos mililitros de medio de diferenciación de cardiomiocitos, dos por pozo.
En el segundo día, reemplace los sobrenadantes con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio uno. En el tercer día, reemplace los sobrenadantes con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio tres. El quinto día.
Reemplace el sobrenadante con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio uno. En el día siete al 10, reemplace el sobrenadante con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio cuatro. Los días 11 y 13.
Cuando se observen células contraídas, reemplace el sobrenadante con dos mililitros de diferenciación de cardiomiocitos medio cinco. Los días 15, 17, 19 y 21. Sustituir el sobrenadante por dos mililitros de diferenciación cardiomiocitaria medio cuatro.
Después del precultivo con medio sanguíneo completo por siete días, los PBMC se vuelven grandes con núcleos y citoplasma visibles que indican que están listos para la transfección con factores de reprogramación del virus de Sendai. Tras la introducción al medio E8 completo. Las células completamente reprogramadas se unirán y comenzarán a formar colonias.
Después de cuatro a cinco pasajes, se formarán colonias de iPSC altamente puras a partir de las células reprogramadas con muy pocas células diferenciadas observadas. En esta etapa, la mayoría de las células son OCT4 y NANOG positivas indicativas de su pluripotenia. Los cardiomiocitos que golpean generalmente se observan después de 12 días de diferenciación.
Después de la inanición de glucosa y el replanteo, los cardiomiocitos iPSC exhiben, latidos espontáneos y una estructura de sarcómero alineada con troponina T cardíaca intercalada y expresión de alfa actinina. Las colonias conservan su pureza como lo demuestra su expresión de troponina T. Aunque los cardiomiocitos iPSC son relativamente inmaduros en comparación con los cardiomiocitos adultos.
Demuestran potenciales de acción similares a los ventriculares y auriculares medidos por parche al por mayor, pinza. Los cardiomiocitos ventriculares expresan miosina de cadena ligera dos, mientras que los cardiomiocitos iPSC auriculares están marcados por la expresión de NR2F2. La activación Wnt estimula la división celular y promueve la expresión de los reguladores del ciclo celular.
Curiosamente, la activación de Wnt también induce la proliferación robusta de cardiomiocitos iPSC tempranos para dos pasajes en comparación con los controles, aunque esta capacidad proliferativa disminuye con el tiempo. Asegúrese de que los PBMS se amplíen con el nuclear y el citoplasma claros antes de que se introduzcan los vectores de reprogramación de iPSC, ya que la condición de los PBM es crítica para la reprogramación de iPSC. Los cardiomiocitos específicos del paciente son valiosos para modelar la enfermedad cardiovascular in vitro y para proporcionar una tonelada de células donantes para la terapia con células madre cardíacas.
