Il s’agit d’installations de protocole complètes, de la génération de boosts bruts et de l’utilisation de cultures spécifiques au patient à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique. Ces tactiques sont reproductibles et faciles à suivre, spécialement pour les débutants. Et n’avez pas besoin d’une expertise spéciale en ballades de cellules souches ou en médecine cardiovasculaire.
Notre protocole peut être utilisé pour générer des cardiomyocytes spécifiques au patient à partir d’une seule prise de sang qui peut être utilisée pour modéliser les maladies cardiovasculaires et tester la toxicité cardiaque de nouveaux médicaments. Ce protocole nécessite un engagement de longue date pour la maintenance de la reprogrammation des cellules souches et la différenciation dirigée. Cependant, vous appréciez vraiment vos efforts.
Quand vous voyez battre les cardiomyocytes dans le plat. Lorsque les colonies humaines d’iPSC atteignent plus de 90% de confluence, rincez chaque puits avec trois millilitres de DPBS avant de traiter les cellules avec un millilitre d’EDTA de 0,5 millimolaire dans le DPBS par puits à 37 degrés Celsius. Après cinq à huit minutes, ajoutez un millilitre de milieu de passage iPSC à chaque puits et délogez manuellement les cellules.
Transférer 600 à 900 microlitres des cellules à des puits individuels ont une membrane basale recouverte de six plaques de puits pour une incubation de nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, rafraîchissez les cultures avec deux millilitres de milieu E8 complet tous les jours pendant trois à quatre jours. Lorsque la culture a atteint la confluence, remplacez le milieu par deux millilitres de milieu de différenciation cardiomyocytaire, deux par puits.
Le deuxième jour, remplacez les surnageants par deux millilitres de milieu de différenciation cardiomyocytaire un. Le troisième jour, remplacez les surnageants par deux millilitres de milieu de différenciation cardiomyocytaire trois. Le cinquième jour.
Remplacez le surnageant par deux millilitres de milieu de différenciation cardiomyocytaire un. Du septième au 10e jour, remplacez le surnageant par deux millilitres de milieu de différenciation cardiomyocytaire quatre. Les jours 11 et 13.
Lorsque des cellules contractantes sont observées, remplacez le surnageant par deux millilitres de milieu de différenciation cardiomyocytaire cinq. Les jours 15, 17, 19 et 21. Remplacez le surnageant par deux millilitres de milieu de différenciation cardiomyocytaire quatre.
Après une pré-culture avec un milieu sanguin complet tous les sept jours, les PBMC deviennent gros avec des noyaux visibles et du cytoplasme indiquant qu’ils sont prêts pour la transfection avec des facteurs de reprogrammation du virus Sendai. Lors de l’introduction au support E8 complet. Les cellules complètement reprogrammées vont s’attacher et commencer à former des colonies.
Après quatre à cinq passages, des colonies d’iPSC très pures se formeront à partir des cellules reprogrammées avec très peu de cellules différenciées observées. À ce stade, la plupart des cellules sont OCT4 et NANOG positives indiquant leur pluripotène. Battre les cardiomyocytes est généralement observé après 12 jours de différenciation.
Après la famine de glucose et la replaquage des cardiomyocytes iPSC, des battements spontanés et une structure de sarcomère alignée avec une expression de troponine T cardiaque intercalée et d’alpha actinine. Les colonies conservent leur pureté comme en témoigne leur expression de troponine T. Bien que les cardiomyocytes iPSC soient relativement immatures par rapport aux cardiomyocytes adultes.
Ils démontrent des potentiels d’action ventriculaires et auriculaires tels que mesurés par patch en gros, pince. Les cardiomyocytes ventriculaires expriment la chaîne légère de la myosine deux, tandis que les cardiomyocytes iPSC auriculaires sont marqués par l’expression de NR2F2. L’activation de Wnt stimule la division cellulaire et favorise l’expression des régulateurs du cycle cellulaire.
Fait intéressant, l’activation de Wnt induit également la prolifération robuste des cardiomyocytes iPSC précoces pour deux passages par rapport aux témoins, bien que cette capacité proliférative diminue avec le temps. Assurez-vous que les PBMS sont agrandis avec le nucléaire clair et le cytoplasme avant que les vecteurs de reprogrammation iPSC ne soient introduits, car l’état des PBM est essentiel pour la reprogrammation iPSC. Les cardiomyocytes spécifiques aux patients sont précieux pour modéliser les maladies cardiovasculaires in vitro et pour fournir une tonne de cellules de donneurs pour la thérapie par cellules souches cardiaques.
