Bu kapsamlı protokol tesisleridir, ham üretimi artırır ve periferik kan mononükleer hücrelerinden gelen hastaya özgü kültürlerin atlanmasını kullanır. Bu taktikler, özellikle yeni başlayanlar için tekrarlanabilir ve takip etmesi kolaydır. Ve kök hücre baladları veya kardiyovasküler tıp konusunda özel uzmanlaşmayı gerektirmez.
Protokolümüz, kardiyovasküler hastalıkları modellemek ve yeni ilaçların kardiyak toksisitesini test etmek için kullanılabilecek tek bir kan alımından hastaya özgü kardiyomiyositler üretmek için kullanılabilir. Bu protokol, kök hücre yeniden programlama bakımı ve yönlendirilmiş farklılaşma için uzun süreli bir taahhüt gerektirir. Ancak, çabalarınızı gerçekten takdir edersiniz.
Tabakta kardiyomiyositleri dövdüğünü gördüğünüzde. İnsan iPSC kolonileri% 90'ın üzerinde izdiah ulaştığında, hücreleri 37 santigrat derecede dpbs'de bir mililitre 0,5 milimolar EDTA ile tedavi etmeden önce her bir kuyuyu üç mililitre DPBS ile durulayın. Beş ila sekiz dakika sonra, her kuyuya bir mililitre iPSC geçirme ortamı ekleyin ve hücreleri manuel olarak yerinden sökün.
Hücrelerin 600 ila 900 mikrolitresini tek tek Wells'e aktarın, 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir gecede inkübasyon için altı kuyu plakası kaplanmış bir bodrum membranına sahiptir. Ardından kültürleri üç ila dört gün boyunca her gün iki mililitre tam E8 ortamıyla yenileyin. Kültür izdiah ulaştığında, ortamı iki mililitre kardiyomiyosit farklılaşma ortamıyla değiştirin, kuyu başına iki tane.
İkinci gün, süpernatantları iki mililitre kardiyomiyosit farklılaşma ortamı ile değiştirin. Üçüncü gün, süpernatantları iki mililitre kardiyomiyosit farklılaşması ile değiştirin. Beşinci günde.
Süpernatantı iki mililitre kardiyomiyosit farklılaşma ortamıyla değiştirin. Yedinci ila 10. 11 ve 13.
Büzülen hücreler gözlendiğinde, süpernatantı iki mililitre kardiyomiyosit farklılaşması ile değiştirin. 15, 17, 19 ve 21. Süpernatantı iki mililitre kardiyomiyosit farklılaşma ortamı dört ile değiştirin.
Yedi günde tam kan ortamı ile kültür öncesi sonra, PBMC sendai virüs yeniden programlama faktörleri ile transfection için hazır olduklarını gösteren görünür çekirdek ve sitoplazma ile büyük hale gelmiştir. Tam E8 ortamına giriş üzerine. Tamamen yeniden programlanmış hücreler bağlanacak ve koloniler oluşturmaya başlayacaktır.
Dört ila beş geçişten sonra, çok az farklılaştırılmış hücre gözlenen yeniden programlanmış hücrelerden son derece saf iPSC kolonileri oluşacaktır. Bu aşamada, hücrelerin çoğu PLURIPOTENY'lerinin OCT4 ve NANOG pozitif göstergesidir. Dövme kardiyomiyositler genellikle 12 günlük farklılaşmadan sonra görülür.
Glikoz açlığı ve iPSC kardiyomiyositlerin yeniden sıçraması sonrasında, spontan dayak ve intercalated kardiyak troponin T ve alfa aktinin ekspresyolu hizalanmış sarkomere yapısı sergiler. Koloniler, Troponin T ifadelerinde kanıt olduğu gibi saflıklarını korurlar. İPSC kardiyomiyositler yetişkin kardiyomiyositlere göre nispeten olgunlaşmamış olsa da.
Toptan yama, kelepçe ile ölçülen eylem potansiyelleri gibi ventrikül ve atriyal gösterirler. Ventriküler kardiyomiyositler miyosin ışık zinciri ikiyi ifade ederken, atriyal iPSC kardiyomiyositler NR2F2 ekspresyasyonu ile işaretlenir. Wnt aktivasyonu hücre bölünmesini uyarır ve hücre döngüsü düzenleyicilerinin ekspresyonunu teşvik eder.
İlginçtir ki, Wnt aktivasyonu ayrıca erken iPSC kardiyomiyositlerin kontrollere kıyasla iki pasaj için sağlam çoğalmasını neden eder, ancak bu proliferatif yetenek zamanla azalır. PBM'lerin durumu iPSC yeniden programlanması için kritik olduğundan, iPSC yeniden programlama vektörleri tanıtılmadan önce PBMS'nin net nükleer ve sitoplazma ile büyütüldğüne emin olun. Hastaya özgü kardiyomiyositler kardiyovasküler hastalık in vitro modellemesi ve kardiyak kök hücre tedavisi için bir ton donör hücre sağlamak için değerlidir.
