胶质母细胞瘤干细胞在模式神经元上共同培养，以研究迁移和细胞相互作用

胶质母细胞瘤是具有高侵入性特征的破坏性脑肿瘤。这种共培养系统模仿胶质母细胞在神经元上迁移，以重新概括患者观察到的侵入性途径之一。我们共同文化模型的几何学和组成得到了精确控制。

它确实有助于更好的可重复性，也有助于对复杂的生物过程进行直接量化。这种方法可以通过共同培养刚分离的胶质母细胞和神经元来适应临床诊断。它定义了临床指数，这对于临床结果非常重要。

我们的方法还可用于量化其他迁移细胞，如成纤维细胞或免疫细胞。演示这个程序的将是乔里斯·古永，我团队的博士生。要为微模式制作基板，请通过空气或等离子体激活 18 毫米圆形玻璃盖片 5 分钟，然后将盖片放入干燥器中，用 100 微升三氧硅烷放置一小时，然后以每毫升 100 毫克的速度孵育 PEG-SVA 溶液，为期一小时。

对于凝胶沉积，在孵化结束时，在滑梯中心加入三微升PLPP和50微升绝对乙醇，等到完全干燥。对于玻璃滑动显微模式，将盖子夹安装在 Ludin 腔室中，并将腔室放置在配备自动对焦系统的显微镜的舞台上。成像后，将微模式图像加载到软件中。

自动紫外线照明测序后，使用移液器用 PBS 广泛清洗盖片中的 PLPP。然后用每毫升层蛋白50微克孵育盖片30分钟，然后用PBS进行另一次洗涤。要在微模式盖片上建立胚胎大鼠海马神经元培养，在最后一次洗涤后，用神经元细胞培养介质补充玻璃滑梯水分。

种子5倍10至第四只大鼠海马神经元悬浮在神经巴萨尔介质中，每平方厘米3%马血清富集到每个微模式盖片上，在37摄氏度的5%二氧化碳孵化器中24小时孵化。离心分离胶质母细胞5分钟，在1000 RPM，并恢复颗粒在胶质母细胞培养介质，然后沉积1倍10到第三GBM细胞在微模式神经元。对于细胞的活细胞成像，将共培养置于装有37摄氏度恒温器室的倒显微镜的舞台上，并选择20倍的目标。

然后使用显微镜软件中的多维采集工具箱，根据神经元模式的数量，每两分钟获取一次实时布莱特菲尔德和表观发光的GFP番茄图像，在16个不同位置拍摄12小时。对于神经元网络分析，成像后，从堆栈中选择一个图像。右键单击网络工具以打开相应的选项对话框并调整设置以生成图像的精确细分。

单击"确定"。左键单击网络工具以复制所选图像，并将图像拆分为红色、灰色和绿色通道。选择灰色通道并执行对比拉伸增强，以改善不同区域之间的分离。使用 Sobel 边缘探测器执行 2D 信号处理卷积，按查找边缘命令分组。

对于双重过滤，应用高斯模糊和中位数滤光片来降低噪音并平滑物体信号。要转换为面膜，执行调整的阈值算法以获取黑白像素的二进制图片。接下来，将细胞区域骨架化为一个简单的网络，并使用滤光颗粒去除结果中的小非网络粒子。

网络图像中的网络滤光颗粒。要获得红色和绿色通道，使用调整后的阈值方法进行双重过滤并转换为面膜。使用分析粒子来确定二元绿色图像中的细胞形态。

使用或操作员使用其感兴趣的区域合并所有通道，并将其初始颜色重新调整为简单的 RGB 图像。要执行单细胞动态分析，只需右键单细胞跟踪工具即可打开相应的选项对话框并调整设置以生成图像的精确细分。单击"确定"，然后左键单细胞跟踪以删除灰色通道。

要根据时间生成与图像堆栈相对应的图像，请应用 Z 投影和双滤镜并转换以掩盖单元留下的痕迹。从二进制红色和绿色图像中删除小颗粒，如所示。使用兴趣区域工具选择单元跟踪的每个轮廓，并检查选项对话窗口中的跳过边缘检测框。

隔离原始堆栈上的红色通道，并选择一个感兴趣的区域。双滤除所有图像并转换为面膜，以便确定每个双核核的中心 XY 位置。XY 位置可用于计算单元格的平均方位移、方向比和平均速度。

对于多个单元跟踪分析，只需右键单击跟踪工具，打开相应的选项对话框并调整设置以生成图像的精确细分。左键单击跟踪工具以删除灰色通道。拆分红色和绿色通道，双滤镜，并转换为面膜。

然后使用图像计算器命令与操作员合并通道，只留下位于膜内的原子核信号，并计算所示单元的轨迹图、平均方位、方向比和平均速度。荧光GBM与有图案的神经元共同培养，快速改变其形状，并以随机运动显示神经元扩展的迁移。播种到神经元的GBM细胞显示一个拉长的形状，多个突起跟随神经元轨道，而细胞在层压素上培养时保持其圆形。

在培养的后期阶段，在GBM神经元共生培养中可以观察到与细胞相连的细突起。播种到神经元的GBM细胞比在这些轨迹图中观察到的在层压素上播种的GBM细胞表现出更大的迁移能力。对细胞荧光汇合的分析表明，在500分钟的观察期内，当球体与神经元共同培养时，观察到的细胞迁移比单单在层蛋白上培养的细胞迁移要多。

事实上，在分析结束时，近一半的模式被GBM细胞覆盖，而层压素培养的球体仍然不与盖片相联。根据您想要回答的生物学问题，人们应该注意模式设计和细胞密度是体内条件的代表。细胞可以通过聚焦显微镜固定和成像。

实时成像也是可能的，因为我们的方法不会损害成像能力。该技术非常适合研究分子相互作用，如胶质母细胞和神经元之间的代谢交换。它允许探索功能生物过程。

高通量实验也可用于临床目的。