该协议描述了三种体外分析，这些测定共同评估了人类近端细胞的功能及其与人类GABAergic内创细胞的相互作用。这些测定的结果将提供对内皮细胞和脑部疾病之间联系的关键洞察。这些测定简单、低成本，允许在厘米范围内测量细胞迁移，而其他现有测定无法实现。
GABAergic内科患者的迁移和分布缺陷与精神疾病有关，如自闭症、癫痫、精神分裂症和抑郁症。因此，研究在人类环境中的透镜内皮细胞与GABAergic内皮细胞的相互作用对于解决这些疾病的发病机制至关重要。首先为测定准备人体细胞。
允许人类外皮细胞达到70%至80%的汇合，然后根据手稿的指示分离它们，并使用 trypan 蓝色排除法计算它们。准备人类GABAergic内科龙，温暖的细胞分离溶液和在37摄氏度的神经元介质等分10分钟。然后从每个含有细胞的井中吸出介质，然后用每井一毫米的 PBS 清洗。
通过每井添加0.5毫升预谋的分离溶液，并在37摄氏度下孵育5分钟，分离细胞。孵育后，每井加入一毫升神经元介质，将细胞溶液转移到15毫升锥形管中，轻轻三角分离细胞团。在室温下以380倍G离心细胞5分钟，吸升液，将细胞颗粒重新在一毫升神经元培养中。
然后使用 trypan 蓝色排除数活细胞。在使用前10分钟，在37摄氏度的温度下加热细胞分离溶液和内皮介质的等分，准备控制人类内皮细胞。从每一个井中吸出介质，用每井一毫升的PBS清洗。
将预预热分离溶液的0.5毫升添加到每井中，并在室温下孵育板5分钟，从而分离细胞。然后，每井加入一毫升内皮细胞培养，以中和分离溶液，并将细胞转移到15毫升锥形管中。将细胞在200倍G下离心5分钟，吸升液，并在一毫升内皮细胞培养中重新分配细胞。
然后使用 trypan 排除方法对单元格进行计数。使用无菌刀片切割两井硅胶培养件的三面，准备一个井培养物刀片。用无菌钳子取出刀片，并将其放在聚 L-ornithine 和层压涂层盘的中心，然后沿着刀片的边缘按压以将其固定到表面上。
小心地将盘子倒置，以验证刀片是否牢固地粘附，并使用永久黑市用超细尖端标记刀片室的边界。将人体GABAergic内膜在神经元培养基和人类外向性内皮细胞和内皮细胞培养基中悬浮，浓度为每70微升3万，然后在每个井培养物插入体内播种70微升细胞溶液。在神经元培养皿中加入一毫升神经元培养基，以填充刀片周围的区域，防止涂层干燥。
同样，在心室内皮细胞培养皿中加入一毫升内皮细胞介质。在显微镜下检查细胞，以验证它们是否从插入室泄漏，然后在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育24小时。孵育后，在显微镜下再次检查细胞，以验证它们是否正确连接。
播种48小时后，用无菌钳子轻轻取出刀片，并在显微镜下检查细胞，以验证细胞层是否不受干扰。从神经元和外皮细胞培养皿中去除培养基，并给每个菜中加入一毫升新鲜培养基。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞5天。
然后，取出介质，用4%PFA固定细胞10分钟，然后用PBS洗涤三次。为了进行共培养测定，在共培养培养基的70微升中悬浮3万个GABAergic内膜和3万个人类透镜内皮细胞，然后在一个井插入舱内播种这种细胞溶液。48 小时后，拆下刀片。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育5天。孵育后，取出介质，用4%PFA固定细胞，用PBS洗涤三次。要执行化学吸引力测定，在聚 L-ornithine 和层压涂层的 35 毫米盘的中心放置三井培养物，将培养皿倒置，并使用带超细尖端的永久标记标记刀片的中间隔间周围的边界。
种子3万GABAergic内皮瘤在70微升的神经元介质在中间的隔间，然后种子10，000个透体内皮细胞和10，000控制内皮细胞和70微升各自的介质在两个外层隔间。沿菜的侧面加入一毫升共培养基，以防止盘子上的涂层干燥。48小时后，取出插入物，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞36小时。
孵育后，取出介质，固定细胞，用PBS洗涤三次。长距离和共培养迁移分析用于研究心室内皮细胞和GABAergic神经元之间的相互作用。在长距离迁移测定中，细胞在第 0 天开始作为矩形斑块，但到 48 小时后，它们已迁移到无细胞空间。
具有抗活性卡斯帕塞-3抗体的免疫细胞化学染色，是凋亡的标记物，在种子神经元中未显示凋亡信号。在联合培养迁移测定中，当内维龙与人类外向性内皮细胞共同播种时，神经元与单独播种或与对照内皮细胞共同播种时相比，距离更远。在化疗吸引力测定中，与对照性内皮细胞相比，向内皮内皮细胞迁移的内皮细胞数量显著增加，这证实了GABAergic内皮龙对由透卵管内皮细胞分泌的化疗吸引力线索有选择性的反应。
这些测定可以使用配体、抑制剂或分析法进行修饰，从而获得对人类外向性内皮细胞与人类内皮素相互作用的机械见解。它们还可用于研究人类外皮细胞与其他神经细胞的相互作用，如我们小组和其他人报告。尝试此过程时，必须将刀片牢固地固定在培养皿上，并在整个检测过程中保持不受干扰，否则可能导致插入物与绘制边界发生细胞泄漏、细胞分离或错位。
我们的工作已经表明，人类近端膜细胞在精神分裂症、癫痫和自闭症等精神疾病的发病机制中具有细胞自主作用。因此，这些检测将允许使用IPSC技术评估这些疾病患者衍生的病性内皮细胞。
