Los glioblastomas son tumores cerebrales devastadores con un alto perfil invasivo. Este sistema de co-cultivo imita la migración de las células de glioblastoma en las neuronas para recapitular una de las rutas invasivas observadas en los pacientes. La geometría y composición de nuestro modelo de co-cultivo se controla con precisión.
Facilita una mejor reproducibilidad y también una cuantificación directa de procesos biológicos complejos. Este método se puede adaptar a la diagnosis clínica co-cultivando las células y las neuronas recién disociadas del glioblastoma. Define un índice clínico, que es muy importante como resultado clínico.
Nuestro método también se puede utilizar para cuantificar otras células migratorias, como fibroblastos o células inmunes. Demostrando el procedimiento estará Joris Guyon, un estudiante de doctorado de mi equipo. Para hacer un sustrato para el micropatterning, tratar 18 milímetros de tapas de vidrio circulares por aire o activación de plasma durante cinco minutos antes de colocar los cubrebocas en un desecador con 100 microlitros de trietoxisilano durante una hora, a continuación, incubar una solución de PEG-SVA a 100 miligramos por mililitro durante una hora.
Para la deposición de gel, al final de la incubación, agregue tres microlitros de PLPP y 50 microlitros de etanol absoluto en el centro del portaobjetos y espere hasta que se seque por completo. Para el micropatterning de diapositivas de vidrio, monte el cubrebocas en una cámara Ludin y coloque la cámara en el escenario de un microscopio equipado con un sistema de enfoque automático. Después de la creación de imágenes, cargue las imágenes de micropatrones en el software.
Después de la secuenciación automática de iluminación UV, utilice una pipeta para lavar el PLPP de la cubierta extensivamente con PBS. A continuación, incubar el cubrebocas con 50 microgramos por mililitro de laminina durante 30 minutos, seguido de otro lavado con PBS como se ha demostrado. Para establecer un cultivo de neuronas del hipocampo de rata embrionaria en las cubiertas de micropatrones, después del último lavado, rehidrate los portaobjetos de vidrio con medio de cultivo celular neuronal.
Semilla cinco veces 10 a las cuartas neuronas del hipocampo de la rata suspendidas en medio neurobasal enriquecido con el suero del caballo del 3%por centímetro cuadrado sobre cada cubrebocas micropatterned para una incubación de 24 horas en una incubadora del dióxido de carbono del 5% en 37 grados de centígrado. Centrífuga disociado células de glioblastoma durante cinco minutos a 1, 000 RPM y resuspend la pelotilla en el medio de cultivo celular de glioblastoma, a continuación, depositar una vez 10 a las terceras células GBM sobre las neuronas micropatterned. Para obtener imágenes de células vivas de las células, coloque el co-cultivo en el escenario de un microscopio invertido equipado con una cámara de termostato de 37 grados Celsius y seleccione el objetivo 20X.
A continuación, utilice la caja de herramientas de adquisiciones multidimensionales en el software de microscopio para adquirir imágenes de tomate GFP brightfield y epifluorescencia en vivo cada dos minutos durante 12 horas en 16 posiciones diferentes en función del número de patrones con neuronas. Para el análisis de redes neuronales, después de la creación de imágenes, seleccione una imagen de la pila. Haga clic con el botón derecho en la herramienta de red para abrir el cuadro de diálogo de opciones correspondiente y ajustar la configuración para producir una segmentación precisa de las imágenes.
Haga clic en Aceptar. Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta de red para duplicar la imagen seleccionada y dividirla en los canales de color rojo, gris y verde. Seleccione el canal gris y realice la mejora de estiramiento de contraste para mejorar la separación entre las diferentes áreas. Utilice el detector de borde Sobel para realizar la convolución de procesamiento de señal 2D tal como se agrupa bajo el comando find edge.
Para el doble filtrado, aplique desenfoque gaussiano y un filtro mediano para reducir el ruido y suavizar la señal del objeto. Para convertir a máscara, ejecute algoritmos de umbral adaptados para obtener una imagen binaria con píxeles en blanco y negro. A continuación, esqueletice el área de la celda en una red simple y utilice partículas de filtro para eliminar pequeñas partículas no interconectadas en los resultados.
Partículas de filtro de red en una imagen de red. Para obtener canales rojos y verdes, realice un doble filtrado y conviértalo en máscara, como se muestra mediante el método de umbral adaptado. Utilice analizar partículas para determinar la morfología celular en la imagen verde binaria.
Utilice el operador or para combinar todos los canales utilizando sus regiones de interés y reajustar su color inicial en una imagen RGB simple. Para realizar un análisis de motilidad de una sola celda, haga clic con el botón derecho en la herramienta de seguimiento de una sola celda para abrir el cuadro de diálogo de opciones correspondiente y ajustar la configuración para producir una segmentación precisa de las imágenes. Haga clic en Aceptar y haga clic con el botón izquierdo en seguimiento de una sola celda para quitar el canal gris.
Para generar una imagen correspondiente a una pila de imágenes según el tiempo, aplique la proyección Z y el doble filtro y convierta para enmascarar los rastros dejados por las celdas. Quite las partículas pequeñas de la imagen binaria roja y verde como se muestra. Utilice la herramienta región de interés para seleccionar cada contorno del trazado de celda y active el cuadro de detección de bordes de omisión en la ventana de diálogo de opciones.
Aísle el canal rojo en la pila original y seleccione una región de interés. Doble filtro de todas las imágenes y convertir a máscara para permitir que se determine la posición centroide XY de cada núcleo binarizado. Las posiciones XY se pueden utilizar para calcular el desplazamiento cuadrático medio, la relación de direccionalidad y la velocidad media de la celda.
Para el análisis de seguimiento de varias celdas, haga clic con el botón derecho en la herramienta de seguimiento para abrir el cuadro de diálogo de opciones correspondiente y ajustar la configuración para producir una segmentación precisa de las imágenes. Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta de seguimiento para eliminar el canal gris. Divida los canales rojo y verde, doble filtro y convertir a máscara.
Luego use el comando de calculadora de imágenes con el operador and para fusionar los canales dejando solo la señal del núcleo ubicada dentro de las membranas y calcule la gráfica de trayectoria, el desplazamiento cuadrático medio, la relación de direccionalidad y la velocidad promedio de las celdas como se ha demostrado. Gbm fluorescente co-cultivado con neuronas modeladas modifican rápidamente su forma y muestran la migración a lo largo de extensiones neuronales en un movimiento aleatorio. Las células GBM sembradas en las neuronas muestran una forma alargada con múltiples protuberancias que siguen las huellas de las neuronas, mientras que las células conservan su forma redondeada cuando se cultivan en laminina.
En etapas posteriores del cultivo, se pueden observar protuberancias delgadas que se unen a las células en los cocultivos neuronales de GBM. Las células GBM sembradas en las neuronas demuestran una mayor capacidad migratoria que las células GBM sembradas en laminina como se observa en estas gráficas de trayectoria. El análisis de la confluencia fluorescente de las células demuestra que durante un período de observación de 500 minutos, se observa más migración celular cuando los esferoides se co-cultivan con las neuronas que cuando las células se cultivan solo en laminina.
De hecho, al final del análisis, casi la mitad del patrón está cubierto con células GBM, mientras que los esferoides cultivados en laminina permanecen intactos al cubrebocas. Dependiendo de las preguntas biológicas que desee responder, uno debe tener cuidado de que el diseño del patrón y también la densidad celular sean representativos de las condiciones in vivo. Las células pueden ser fijadas e imágenes por microscopía confocal.
La proyección de imagen viva es también posible puesto que nuestro método no empeora las capacidades de la proyección de imagen. Esta técnica es muy adecuada para estudiar la interacción molecular, como los intercambios metabólicos entre las células y las neuronas del glioblastoma. Permite la exploración de procesos biológicos de función.
Los experimentos de alto rendimiento también se pueden hacer con fines clínicos.
