Glioblastomas são tumores cerebrais devastadores com alto perfil invasivo. Este sistema de cocultura imita a migração de células glioblastoma em neurônios para recapitular uma das rotas invasivas observadas em pacientes. A geometria e composição do nosso modelo de co-cultura é precisamente controlada.
Facilita uma melhor reprodutibilidade e também uma quantificação direta de processos biológicos complexos. Este método pode ser adaptado ao diagnóstico clínico por co-cultivo de células e neurônios de glioblastoma recém-dissociados. Define um índice clínico, que é muito importante como desfecho clínico.
Nosso método também pode ser usado para quantificar outras células migratórias, como fibroblastos ou células imunes. Demonstrando o procedimento será Joris Guyon, um estudante de doutorado da minha equipe. Para fazer um substrato para o micropatterning, trate as tampas de vidro circular de 18 milímetros por ativação de ar ou plasma por cinco minutos antes de colocar as tampas em um dessecador com 100 microlitres de trietoxisilano por uma hora e, em seguida, incubar uma solução de PEG-SVA a 100 mililitos por mililitro por uma hora.
Para deposição de gel, no final da incubação, adicione três microliters de PLPP e 50 microliters de etanol absoluto no centro do slide e espere até que seca completamente. Para micropatters de slides de vidro, monte o deslizamento de tampa em uma câmara Ludin e coloque a câmara no palco de um microscópio equipado com um sistema de foco automático. Após a imagem, carregue as imagens de micropattern no software.
Após o sequenciamento automático da iluminação UV, use uma pipeta para lavar o PLPP do deslizamento de tampas extensivamente com PBS. Em seguida, incubar o deslizamento de cobertura com 50 microgramas por mililitro de laminina por 30 minutos, seguido de outra lavagem com PBS como demonstrado. Para configurar uma cultura de neurônio hipocampal de ratos embrionários nas tampas de micropattern, após a última lavagem, reidratar os slides de vidro com meio de cultura celular neuronal.
Semente cinco vezes 10 para o quarto rato neurônios hipocampais suspensos em meio neurobásico enriquecido com 3% de soro de cavalo por centímetro quadrado em cada deslizamento de cobertura micropatterada para uma incubação de 24 horas em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius. Centrífuga dissociada células de glioblastoma por cinco minutos a 1.000 RPM e resuspensa a pelota no meio de cultura celular glioblastoma, em seguida, depositar uma vez 10 para o terceiro GBM células sobre os neurônios micropatterados. Para imagens de células vivas das células, coloque a co-cultura no palco de um microscópio invertido equipado com uma câmara de termostato Celsius de 37 graus e selecione o objetivo de 20X.
Em seguida, use a caixa de ferramentas de aquisições multidimensionais no software de microscópio para adquirir imagens vivas de tomate Brightfield e epifluorescência GFP a cada dois minutos por 12 horas em 16 posições diferentes com base no número de padrões com neurônios. Para análise da rede neuronal, após a imagem, selecione uma imagem da pilha. Clique com o botão direito do mouse na ferramenta de rede para abrir a caixa de diálogo de opções correspondentes e ajustar as configurações para produzir uma segmentação precisa das imagens.
Clique em OK. Clique à esquerda na ferramenta de rede para duplicar a imagem selecionada e dividir a imagem nos canais de cores vermelho, cinza e verde. Selecione o canal cinza e realize o aprimoramento do estiramento de contraste para melhorar a separação entre as diferentes áreas. Use o detector de bordas Sobel para executar a convolução de processamento de sinal 2D agrupada sob o comando find edge.
Para filtragem dupla, aplique desfoque gaussiano e um filtro mediano para reduzir o ruído e suavizar o sinal do objeto. Para converter em máscara, execute algoritmos de limiar adaptados para obter uma imagem binária com pixels preto e branco. Em seguida, eleletize a área celular em uma rede simples e use partículas de filtro para remover pequenas partículas não-em rede nos resultados.
Partículas de filtro de rede em uma imagem de rede. Para obter canais vermelhos e verdes, realize filtragem dupla e converta-se em máscara, conforme demonstrado usando o método de limiar adaptado. Use partículas de análise para determinar a morfologia celular na imagem verde binária.
Use o ou operador para mesclar todos os canais usando suas regiões de interesse e reajustar sua cor inicial em uma imagem RGB simples. Para realizar uma análise de motilidade unicelular, clique com o botão direito do mouse na ferramenta de rastreamento de célula única para abrir a caixa de diálogo de opções correspondentes e ajustar as configurações para produzir uma segmentação precisa das imagens. Clique em OK e clique à esquerda no rastreamento de célula única para remover o canal cinza.
Para gerar uma imagem correspondente a uma pilha de imagens de acordo com o tempo, aplique projeção Z e filtro duplo e converta para mascarar as trilhas deixadas pelas células. Remova as pequenas partículas da imagem binária vermelha e verde, como demonstrado. Use a ferramenta região de interesse para selecionar cada contorno do traço da célula e verificar a caixa de detecção de borda de pular na janela de diálogo de opções.
Isole o canal vermelho na pilha original e selecione uma região de interesse. Filtre duas vezes todas as imagens e converta-se em máscara para permitir que a posição centroide XY de cada núcleo binarizado seja determinada. As posições XY podem ser usadas para calcular o deslocamento quadrado médio, a razão de direcionalidade e a velocidade média para a célula.
Para análise de rastreamento de várias células, clique com o botão direito do mouse na ferramenta de rastreamento para abrir a caixa de diálogo de opções correspondentes e ajustar as configurações para produzir uma segmentação precisa das imagens. Clique à esquerda na ferramenta de rastreamento para remover o canal cinza. Divida os canais vermelho e verde, filtro duplo e converta em máscara.
Em seguida, use o comando da calculadora de imagens com o operador e o operador para mesclar os canais deixando apenas o sinal do núcleo localizado dentro das membranas e calcular o enredo de trajetória, deslocamento quadrado médio, razão de direcionalidade e velocidade média para as células como demonstrado. GbM fluorescente co-cultivado com neurônios padronizados rapidamente modificam sua forma e mostram migração ao longo de extensões neuronais em um movimento aleatório. As células GBM semeadas em neurônios exibem uma forma alongada com múltiplas saliências que seguem as trilhas dos neurônios enquanto as células mantêm sua forma arredondada quando cultivadas em laminina.
Em estágios posteriores da cultura, saliências finas ligando-se às células podem ser observadas em co-culturas neuronais GBM. As células GBM semeadas em neurônios demonstram uma maior capacidade migratória do que as células GBM semeadas em laminina, como observado nessas parcelas de trajetória. A análise da confluência fluorescente das células demonstra que, ao longo de um período de observação de 500 minutos, mais migração celular é observada quando os esferoides são co-cultivados com neurônios do que quando as células são cultivadas apenas em laminina.
De fato, ao final da análise, quase metade do padrão é coberto com células GBM, enquanto os esferoides cultivados na laminina permanecem não aadesivos ao deslizamento de cobertura. Dependendo das questões biológicas que você deseja responder, deve-se ter cuidado para que o desenho do padrão e também a densidade celular sejam representativas das condições in vivo. As células podem ser fixadas e imagens por microscopia confocal.
Imagens ao vivo também são possíveis, uma vez que nosso método não prejudica as capacidades de imagem. Esta técnica é adequada para estudar a interação molecular, como trocas metabólicas entre células de glioblastoma e neurônios. Permite a exploração de processos biológicos de função.
Experimentos de alto rendimento também podem ser feitos para fins clínicos.
