I glioblastomi sono tumori cerebrali devastanti con un alto profilo invasivo. Questo sistema di co-coltura imita la migrazione delle cellule del glioblastoma sui neuroni per ricapitolare una delle vie invasive osservate nei pazienti. La geometria e la composizione del nostro modello di co-coltura sono controllate con precisione.
Facilita una migliore riproducibilità e anche una semplice quantificazione di processi biologici complessi. Questo metodo può essere adattato alla diagnosi clinica co-coltivando cellule e neuroni del glioblastoma appena dissociati. Definisce un indice clinico, che è molto importante come risultato clinico.
Il nostro metodo può anche essere utilizzato per quantificare altre cellule migrate, come fibroblasti o cellule immunitarie. A dimostrare la procedura sarà Joris Guyon, dottoranda del mio team. Per realizzare un substrato per il micropatterning, trattare 18 millimetri di coverlips di vetro circolare per attivazione aria o plasma per cinque minuti prima di posizionare i coprispacchi in un essiccatore con 100 microlitri di trietossisilano per un'ora, quindi incubare una soluzione di PEG-SVA a 100 milligrammi per millilitro per un'ora.
Per la deposizione di gel, al termine dell'incubazione, aggiungere tre microlitri di PLPP e 50 microlitri di etanolo assoluto al centro dello scivolo e attendere che si ascili completamente. Per il micropatterning a vetri, montare il coverslip in una camera Ludin e posizionare la camera sul palco di un microscopio dotato di un sistema di messa a fuoco automatica. Dopo l'imaging, caricare le immagini micropattern nel software.
Dopo il sequenziamento automatico dell'illuminazione UV, utilizzare una pipetta per lavare ampiamente il PLPP dal coperchio con PBS. Quindi incubare il coverslip con 50 microgrammi per millilitro di laminina per 30 minuti, seguito da un altro lavaggio con PBS come dimostrato. Per impostare una coltura neuronale ippocampale del ratto embrionale sui coprili di micropattern, dopo l'ultimo lavaggio, reidratare le diapositive di vetro con il mezzo di coltura cellulare neuronale.
Seme cinque volte 10 al quarto ratto neuroni ippocampali sospesi in mezzo neurobasale arricchito con siero di cavallo al 3% per centimetro quadrato su ogni coverslip micropatterned per un'incubazione di 24 ore in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Centrifugare le cellule di glioblastoma dissociate per cinque minuti a 1.000 RPM e rimostrare il pellet nel mezzo di coltura cellulare del glioblastoma, quindi depositare una volta 10 alle terze cellule GBM sui neuroni micropatterned. Per l'imaging a cellule vive delle cellule, posizionare la co-coltura sullo stadio di un microscopio invertito dotato di una camera termostato Celsius di 37 gradi e selezionare l'obiettivo 20X.
Quindi usa la cassetta degli attrezzi di acquisizioni multidimensionali nel software per microscopio per acquisire immagini di pomodoro GFP Brightfield ed epifluorescenza dal vivo ogni due minuti per 12 ore in 16 posizioni diverse in base al numero di modelli con i neuroni. Per l'analisi della rete neuronale, dopo l'imaging, selezionare un'immagine dallo stack. Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento di rete per aprire la finestra di dialogo delle opzioni corrispondenti e regolare le impostazioni per produrre una segmentazione precisa delle immagini.
Fare clic su OK. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo strumento di rete per duplicare l'immagine selezionata e dividere l'immagine nei canali di colore rosso, grigio e verde. Selezionate il canale grigio ed eseguite il miglioramento dell'allungamento del contrasto per migliorare la separazione tra le diverse aree. Utilizzate il rilevatore di spigoli Sobel per eseguire la convoluzione di elaborazione del segnale 2D raggruppata sotto il comando trova bordo.
Per il doppio filtraggio, applicate la sfocatura gaussiana e un filtro mediano per ridurre il rumore e smussare il segnale dell'oggetto. Per convertire in maschera, eseguire algoritmi di soglia adattati per ottenere un'immagine binaria con pixel in bianco e nero. Successivamente, scheletrare l'area cellulare in una semplice rete e utilizzare particelle di filtro per rimuovere piccole particelle non in rete nei risultati.
Particelle di filtro di rete in un'immagine di rete. Per ottenere canali rossi e verdi, eseguire il doppio filtraggio e convertirlo in maschera, come illustrato utilizzando il metodo di soglia adattato. Utilizzare le particelle di analisi per determinare la morfologia cellulare nell'immagine verde binaria.
Utilizzare l'operatore o per unire tutti i canali utilizzando le rispettive aree di interesse e riadattare il colore iniziale in una semplice immagine RGB. Per eseguire un'analisi della motilità a cella singola, fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento di rilevamento di singole celle per aprire la finestra di dialogo delle opzioni corrispondenti e regolare le impostazioni per produrre una segmentazione precisa delle immagini. Fare clic su OK e fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul rilevamento a cella singola per rimuovere il canale grigio.
Per generare un'immagine corrispondente a uno stack di immagini in base all'ora, applicare la proiezione Z e il doppio filtro e convertire in maschera le tracce lasciate dalle celle. Rimuovere le piccole particelle dall'immagine binaria rossa e verde come dimostrato. Utilizzate lo strumento Area di interesse (Region of Interest) per selezionare ogni contorno della traccia delle celle e selezionare la casella ignora rilevamento spigoli nella finestra di dialogo delle opzioni.
Isolare il canale rosso nello stack originale e selezionare un'area di interesse. Filtrare due volte tutte le immagini e convertirsi in maschera per consentire di determinare la posizione XY baricentro di ogni nucleo binarizzato. Le posizioni XY possono essere utilizzate per calcolare lo spostamento quadrativo medio, il rapporto direzionalità e la velocità media per la cella.
Per l'analisi del rilevamento di più celle, fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento di tracciamento per aprire la finestra di dialogo delle opzioni corrispondenti e regolare le impostazioni per produrre una segmentazione precisa delle immagini. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo strumento di tracciamento per rimuovere il canale grigio. Dividere i canali rosso e verde, filtrare due filtri e convertirli in maschera.
Quindi utilizzare il comando calcolatrice immagine con l'operatore e per unire i canali lasciando solo il segnale del nucleo situato all'interno delle membrane e calcolare il grafico della traiettoria, lo spostamento quadrato medio, il rapporto direzionalità e la velocità media per le cellule come dimostrato. Gbm fluorescente co-coltivato con neuroni modellati modificano rapidamente la loro forma e mostrano la migrazione lungo le estensioni neuronali in un movimento casuale. Le cellule GBM seminate sui neuroni mostrano una forma allungata con protrusioni multiple che seguono le tracce neuronali mentre le cellule mantengono la loro forma arrotondata quando coltivate sulla laminina.
Nelle fasi successive della coltura, sottili sporgenze che si collegano alle cellule possono essere osservate nelle co-culture neuronali GBM. Le cellule GBM sedate sui neuroni dimostrano una maggiore capacità migratoria rispetto alle cellule GBM sedate sulla laminina come osservato in questi appezzamenti di traiettoria. L'analisi della confluenza fluorescente delle cellule dimostra che in un periodo di osservazione di 500 minuti, si osserva una maggiore migrazione cellulare quando gli sferoidi sono co-coltivati con i neuroni rispetto a quando le cellule sono coltivate solo sulla laminina.
Infatti, alla fine dell'analisi, quasi la metà del modello è coperto da cellule GBM mentre gli sferoidi coltivati sulla laminina rimangono non aderenti al coverslip. A seconda delle domande biologiche a cui vuoi rispondere, dovresti fare attenzione che il design del modello e anche la densità cellulare siano rappresentativi delle condizioni in vivo. Le cellule possono essere fisse e immagini mediante microscopia confocale.
L'imaging dal vivo è anche possibile poiché il nostro metodo non compromette le capacità di imaging. Questa tecnica è adatta per studiare l'interazione molecolare, come gli scambi metabolici tra cellule di glioblastoma e neuroni. Permette l'esplorazione di processi biologici di funzione.
Gli esperimenti ad alta produttività possono essere eseguiti anche per scopi clinici.
