Este protocolo descreve um processo experimental passo-a-passo e um algoritmo matemático para quantificar o FRET usando a têmpera do doador e a emissão sensibilizada pelo aceitador. A quantificação das eficiências de FRET na célula viva requer a determinação do crosstalk das proteínas fluorescentes e das eficiências relativas de emissão e detecção dos fluoróforos na configuração microscópica. O crosstalk pode ser avaliado por células de imagem que expressam apenas um fluoróforo.
A avaliação da eficiência de detecção de uma molécula dadora ou de uma molécula aceptora requer um conhecimento da razão entre o número de moléculas dadoras e aceitadoras que dão origem ao sinal de medida. O número de fluoróforos expressos em células vivas varia de célula para célula e é desconhecido. A sonda de calibração utilizada neste método, uma proteína de fusão um-para-um doador-aceptor, permite determinar a eficiência relativa de detecção de moléculas doadoras e aceitadoras.
Para começar, use um vetor de expressão de células de mamíferos N1 com mCherry 1 para gerar a sonda de fusão EGFP mCherry 1. Projetar oligonucleotídeos para amplificar o EGFP sem um códon de parada como um fragmento de célula um BAM h1. O ligador de cinco aminoácidos entre a proteína fluorescente verde e vermelha deve produzir uma deficiência média de FRET para o par doador-aceptor de cereja GFP de 0,25 a 0,3.
Use qualquer linhagem celular e meio sem vermelho de fenol para reduzir a fluorescência de fundo. Uma vez que as células estejam 80% confluentes, separe-as com um mililitro de EDTA de 0,05% de tripsina e semeie cerca de 10.000 células em cada poço de uma placa de oito poços, adicionando três gotas de uma suspensão celular de cinco mililitros. 24 horas após o revestimento, transfecte as células usando um meio de transfecção apropriado.
Incubar as células por 20 horas antes da imagem de células vivas para permitir a expressão, o enovelamento e a maturação adequados de proteínas fluorescentes. Fotografe as células em uma câmara ambiental umidificada e aquecida a 37 graus Celsius com um microscópio de varredura confocal. Para tamponar o meio celular em pH fisiológico, adicione 20 HEPES milimolares para tornar o meio celular independente do dióxido de carbono.
Em seguida, monte a lâmina no microscópio. Use a linha de 488 nanômetros do laser de íons de argônio para excitar a GFP e o laser de diodo de 561 nanômetros para excitar a cereja. Configure o laser de 488 nanômetros para excitação no canal um através de uma banda de emissão de 505 a 530 nanômetros e no canal dois com um filtro de passagem longa de mais de 585 nanômetros.
Use o laser de 561 nanômetros para excitação no canal três com um filtro passa-longo de mais de 585 nanômetros. Excite os dois lasers sequencialmente e defina o modo de imagem para alternar após cada linha para que a excitação da imagem de 512 por 512 pixels se alterne após cada linha. Configure uma minissérie temporal de três imagens para detectar se ocorre fotobranqueamento significativo e reduzir a potência do laser, se necessário.
Primeiro, células de imagem expressando a construção de fusão de cereja GFP. Defina os parâmetros que definem a intensidade do laser integrada ao tempo por pixel em uma imagem confocal. Use uma objetiva de óleo de 63X e zoom definido como 3X para criar uma imagem de uma célula em sua totalidade com ampliação e resolução suficientes.
Aponte para um tamanho de pixel de 70 a 80 nanômetros. Defina o tempo de permanência de pixels para dois a quatro microssegundos e a transmissão AOTF para o laser de 488 nanômetros e 561 nanômetros, de modo que as imagens mostrem uma boa relação sinal-ruído sem qualquer branqueamento e sem pixels indicando saturação de intensidade de fluorescência. Ajuste a potência do laser de 488 e 561 de modo que os níveis de sinal no canal um e no canal três sejam semelhantes.
Defina o ganho do multiplicador de fotos para 600 a 800. Imagem 15 a 20 células expressando a proteína de fusão de cereja GFP, células expressando GFP, cereja, GFP e cereja e células não transectadas. Em seguida, as células de imagem co-expressando as proteínas de interesse acopladas à GFP e à cereja, respectivamente.
Para calcular o FRET, meça o sinal do doador no canal um, o canal doador com excitação de 488 nanômetros e uma banda de emissão de 505 a 530 nanômetros. Em seguida, meça o sinal aceitador no canal três, o canal aceitador com excitação de 561 nanômetros e emissão acima de 585 nanômetros. Finalmente, meça o sinal FRET no canal dois, o canal de transferência com excitação e emissão de 488 nanômetros acima de 585 nanômetros.
O sinal no canal dois é uma soma de quatro componentes diferentes: o transbordamento espectral do sinal do doador apagado para o canal de detecção acima de 585 com um fator de crosstalk S1, o sinal aceptor da excitação direta por luz de 488 nanômetros com um fator de crosstalk S2, a emissão sensibilizada do aceitador pelo FRET a partir da molécula doadora excitada, e o sinal de fundo. As imagens foram obtidas no canal doador, no canal de transferência e no canal aceptor, células expressando GFP apenas, cereja apenas, co-expressando GFP e cereja, e a proteína de fusão de cereja GFP são mostradas. As eficiências celulares médias de FRET calculadas em células NRK que expressam a proteína de fusão de cereja GFP e aquelas que co-expressam a cereja GFP são plotadas versus a razão de intensidade da relação aceptor-doador ou razão molecular em cada célula.
Imagens FRET pixelizadas pixel a pixel de células expressando a proteína de fusão de cereja GFP, co-expressando GFP e cereja como um controle negativo e expressando subunidades receptoras do receptor Ashwell-Morell são mostradas aqui. RHL1 e 2 da lectina hepática de rato foram marcados com GFP e cereja no lado citoplasmático da membrana plasmática. As eficiências celulares médias de FRET das células que expressam GFP RHL1 e do estoque delta de cereja RHL2 e GFP RHL1 e RHL2 de cereja são plotadas versus a relação molecular aceptor-doador.
A abordagem quantitativa FRET apresentada permite o seguinte. Detecção de interações proteicas no contexto fisiológico da célula viva. Mudanças nas interações proteicas ao longo do tempo.
Diferenças nas interações em compartimentos subcelulares até o nível de pixel por pixel de uma imagem confocal. E a dependência do sinal FRET detectado da relação aceptor-doador molecular expressa em uma célula viva.
