Этот протокол описывает пошаговый экспериментальный процесс и математический алгоритм для количественной оценки FRET с использованием донорского гашения и акцепторно-сенсибилизированного излучения. Количественная оценка эффективности FRET в живой клетке требует определения перекрестных помех флуоресцентных белков и относительной эффективности излучения и обнаружения флуорофоров в микроскопической установке. Перекрестные помехи могут быть оценены путем визуализации клеток, экспрессирующих только один флуорофор.
Оценка эффективности детектирования донора или акцепторной молекулы требует знания соотношения числа донорных и акцепторных молекул, дающих сигнал измерения. Количество флуорофоров, экспрессируемых в живых клетках, варьируется от клетки к клетке и неизвестно. Калибровочный зонд, используемый в этом методе, взаимно-однозначный донорно-акцепторный слитый белок, позволяет определить относительную эффективность обнаружения донорных и акцепторных молекул.
Для начала используйте вектор экспрессии клеток млекопитающих N1 с mCherry 1 для создания термоядерного зонда EGFP mCherry 1. Проектирование олигонуклеотидов для амплификации EGFP без стоп-кодона в виде клеточного фрагмента BAM h1. Линкер из пяти аминокислот между зеленым и красным флуоресцентным белком должен давать средний дефицит FRET для пары донор-акцептор вишни GFP от 0,25 до 0,3.
Используйте любую клеточную линию и среду без фенолового красного, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию. Как только клетки будут на 80% сливаться, отделите их одним миллилитром 0,05% трипсина ЭДТА и засейте около 10 000 клеток в каждую лунку восьмилуночной пластины, добавив три капли из пятимиллилитровой клеточной суспензии. Через 24 часа после нанесения покрытия трансфицируйте клетки, используя соответствующую среду для трансфекции.
Инкубируйте клетки в течение 20 часов перед визуализацией живых клеток, чтобы обеспечить надлежащую экспрессию, сворачивание и созревание флуоресцентного белка. Сфотографируйте клетки в увлажненной и нагретой камере окружающей среды при температуре 37 градусов Цельсия с помощью конфокального сканирующего микроскопа. Чтобы буферизовать клеточную среду при физиологическом pH, добавьте 20 миллимолярных HEPES, чтобы сделать клеточную среду независимой от углекислого газа.
Затем установите предметное стекло на микроскоп. Используйте 488-нанометровую линию аргоново-ионного лазера для возбуждения GFP и 561-нанометровый диодный лазер для возбуждения вишни. Настройте 488-нанометровый лазер для возбуждения в первом канале через полосу излучения от 505 до 530 нанометров и во втором канале с фильтром длинных проходов более 585 нанометров.
Используйте 561-нанометровый лазер для возбуждения в третьем канале с фильтром длинных проходов более 585 нанометров. Последовательно возбуждайте два лазера и установите режим визуализации на переключение после каждой строки, чтобы возбуждение изображения размером 512 на 512 пикселей чередовалось после каждой линии. Настройте мини-временной ряд из трех изображений, чтобы определить, происходит ли значительное фотообесцвечивание, и при необходимости уменьшить мощность лазера.
Во-первых, ячейки изображения, экспрессирующие конструкцию слияния вишни GFP. Задайте параметры, определяющие интегрированную по времени интенсивность лазера на пиксель в конфокальном изображении. Используйте 63-кратный масляный объектив и 3-кратное увеличение, чтобы получить изображение ячейки целиком с достаточным увеличением и разрешением.
Стремитесь к размеру пикселя от 70 до 80 нанометров. Установите время выдержки пикселя на две-четыре микросекунды и передачу AOTF для лазера 488 нанометра и 561 нанометра таким образом, чтобы изображения показывали хорошее соотношение сигнал/шум без какого-либо обесцвечивания и без пикселей, указывающих на насыщенность интенсивности флуоресценции. Отрегулируйте мощность лазера 488 и 561 таким образом, чтобы уровни сигнала в первом и третьем каналах были одинаковыми.
Установите коэффициент усиления множителя фотографии от 600 до 800. Изображение От 15 до 20 клеток, экспрессирующих белок слияния вишни GFP, клетки, экспрессирующие GFP, вишню, GFP и вишню, и нетрансецированные клетки. Затем изображения клеток, совместно экспрессирующих интересующие белки, связанные с GFP и вишней соответственно.
Чтобы рассчитать FRET, измерьте донорский сигнал в первом канале, донорском канале с возбуждением 488 нанометров и полосой излучения от 505 до 530 нанометров. Затем измерьте акцепторный сигнал в третьем канале, канале акцептора с возбуждением 561 нанометр и излучением выше 585 нанометров. Наконец, измерьте сигнал FRET во втором канале, передаточном канале с возбуждением 488 нанометров и излучением при температуре выше 585 нанометров.
Сигнал во втором канале представляет собой сумму четырех различных составляющих: спектральный перетекание от погашенного донорского сигнала к каналу детектирования более 585 с коэффициентом перекрестных помех S1, акцепторный сигнал от прямого возбуждения 488-нанометровым светом с коэффициентом перекрестных помех S2, сенсибилизированное излучение акцептора FRET от возбужденной молекулы-донора, и фоновый сигнал. Изображения были получены в донорском канале, транспортном канале и акцепторном канале, показаны клетки, экспрессирующие только GFP, только вишня, коэкспрессирующие GFP и вишня, а также белок слияния вишни GFP. Средняя клеточная эффективность FRET, рассчитанная в клетках NRK, экспрессирующих белок слияния вишни GFP, и в клетках, совместно экспрессирующих вишню GFP, строится в зависимости от отношения акцептора к донору, отношения интенсивности или молекулярного отношения в каждой клетке.
Здесь показаны нормализованные попиксельные FRET-изображения клеток, экспрессирующих белок слияния вишни GFP, коэкспрессирующих GFP и вишню в качестве отрицательного контроля, а также экспрессирующих рецепторных субъединиц рецептора Эшвелла-Морелла. RHL1 и 2 лектина печени крысы были помечены GFP и вишней на цитоплазматической стороне плазматической мембраны. Средняя клеточная эффективность FRET клеток, экспрессирующих GFP RHL1 и вишневый RHL2 и GFP RHL1 дельта-запас и вишневый RHL2, построены в зависимости от молекулярного отношения акцептора к донору.
Представленный количественный подход FRET позволяет добиться следующего. Обнаружение белковых взаимодействий в физиологическом контексте живой клетки. Изменения в белковых взаимодействиях с течением времени.
Различия во взаимодействиях в субклеточных компартментах вплоть до попиксельного уровня конфокального изображения. И зависимость детектируемого сигнала FRET от молекулярного отношения акцептора к донору, выраженного в живой клетке.
