이 프로토콜은 기증자 담금질 및 수용체 감응 방출을 사용하여 FRET를 정량화하는 단계별 실험 프로세스 및 수학적 알고리즘을 설명합니다. 살아있는 세포에서 FRET 효율을 정량화하려면 형광 단백질의 누화와 현미경 설정에서 형광단의 상대적 방출 및 검출 효율을 결정해야 합니다. 누화는 단 하나의 형광단을 발현하는 이미징 세포에 의해 평가될 수 있습니다.
공여체 또는 수용체 분자의 검출 효율을 평가하려면 측정 신호를 발생시키는 공여체 및 수용자 분자의 수의 비율에 대한 지식이 필요합니다. 살아있는 세포에서 발현되는 형광단의 수는 세포마다 다르며 알려져 있지 않습니다. 이 방법에 사용되는 일대일 공여체-수용체 융합 단백질인 교정 프로브를 사용하면 공여체 및 억셉터 분자의 상대적 검출 효율을 결정할 수 있습니다.
먼저, EGFP mCherry 1 융합 프로브를 생성하기 위해 mCherry 1과 함께 N1 포유류 세포 발현 벡터를 사용합니다. 정지 코돈 없이 EGFP를 증폭하는 올리고뉴클레오티드를 세포일 BAM h1 단편으로 설계한다. 녹색 및 적색 형광 단백질 사이의 5개의 아미노산 링커는 0.25 내지 0.3의 GFP 체리 기증자-수용체 쌍에 대한 평균 FRET 결핍을 산출해야 한다.
배경 형광을 줄이기 위해 페놀 레드가 없는 세포주와 배지를 사용하십시오. 세포가 80 % confluent가되면, 0.05 % trypsin EDTA의 1 밀리리터로 그들을 분리하고 5 밀리리터 세포 현탁액에서 3 방울을 첨가하여 8 웰 플레이트의 각 웰에 약 10, 000 개의 세포를 시드한다. 도금 24시간 후, 적절한 형질주입 배지를 사용하여 세포를 형질감염시킨다.
적절한 형광 단백질 발현, 접힘 및 성숙을 허용하기 위해 생세포 이미징 전에 20시간 동안 세포를 배양합니다. 섭씨 37도의 가습 및 가열된 환경 챔버에서 컨포칼 스캐닝 현미경으로 세포를 이미지화합니다. 생리학적 pH에서 세포 배지를 완충하려면 20밀리몰 HEPES를 추가하여 세포 배지를 이산화탄소와 독립적으로 만듭니다.
그런 다음 슬라이드를 현미경에 장착합니다. 아르곤 이온 레이저의 488 나노 미터 라인을 사용하여 GFP를 자극하고 561 나노 미터 다이오드 레이저를 사용하여 체리를 자극합니다. 채널 1에서 505 - 530 나노미터의 방출 대역을 통해 여기용 488 나노미터 레이저를 설정하고 585 나노미터 이상의 롱 패스 필터를 사용하여 채널 2에서 여기합니다.
585 나노미터 이상의 롱 패스 필터와 함께 채널 3의 여기를 위해 561 나노미터 레이저를 사용하십시오. 두 개의 레이저를 순차적으로 여기시키고 각 라인 이후에 전환되도록 이미징 모드를 설정하여 각 라인 다음에 512 x 512 픽셀 이미지의 여기가 번갈아 가도록 합니다. 3개 영상의 미니 시계열을 설정하여 상당한 광표백이 발생하는지 감지하고 필요한 경우 레이저 출력을 줄입니다.
먼저, GFP 체리 융합 구조체를 발현하는 이미지 세포. 공초점 이미지에서 픽셀당 시간 통합 레이저 강도를 정의하는 파라미터를 설정합니다. 63X 오일 대물렌즈를 사용하고 줌을 3X로 설정하여 충분한 배율과 해상도로 셀 전체를 이미지화합니다.
70-80 나노 미터의 픽셀 크기를 목표로합니다. 488 나노미터 및 561 나노미터 레이저의 경우 픽셀 체류 시간을 2-4마이크로초로 설정하고 AOTF 전송을 설정하여 이미지가 표백 없이 우수한 신호 대 잡음비를 표시하고 형광 강도 포화를 나타내는 픽셀이 없도록 합니다. 채널 1과 채널 3의 신호 레벨이 비슷하도록 488 및 561의 레이저 출력을 조정합니다.
사진 배율 게인을 600에서 800으로 설정합니다. 이미지 15 내지 20은 GFP를 발현하는 세포, GFP, GFP 및 체리를 발현하는 세포, 및 비-형질전환된 세포이다. 그런 다음 GFP와 체리에 각각 결합된 관심 단백질을 공동 발현하는 이미지 세포.
FRET를 계산하려면 채널 1, 488 나노미터 여기 및 505 내지 530 나노미터의 방출 대역을 갖는 도너 채널에서 도너 신호를 측정한다. 그런 다음 561 나노미터 여기와 585 나노미터 이상의 방출을 가진 수용체 채널인 채널 3에서 수용체 신호를 측정합니다. 마지막으로 488나노미터 여기와 585나노미터 이상에서 방출되는 전송 채널인 채널 2에서 FRET 신호를 측정합니다.
채널 2의 신호는 4가지 다른 구성 요소의 합입니다: 담금질된 도너 신호에서 누화 계수 S1이 있는 585개 이상의 검출 채널로의 스펙트럼 파급, 누화 계수 S2가 있는 488나노미터 빛에 의한 직접 여기로부터의 수용체 신호, 여기된 기증자 분자에서 FRET에 의한 수용체의 감작된 방출, 그리고 배경 신호. 공여자 채널, 전달 채널 및 수용체 채널에서 이미지를 얻었으며, GFP 만 발현하는 세포, 체리 만, GFP 및 체리 공동 발현 및 GFP 체리 융합 단백질이 표시됩니다. GFP 체리 융합 단백질을 발현하는 NRK 세포와 GFP 체리를 공동 발현하는 NRK 세포에서 계산된 평균 세포 FRET 효율은 각 세포의 수용체 대 기증자 비율 강도 비율 또는 분자 비율에 대해 플롯됩니다.
GFP 체리 융합 단백질을 발현하고, 음성 대조군으로 GFP와 체리를 공동 발현하고, Ashwell-Morell 수용체의 수용체 서브유닛을 발현하는 세포의 픽셀 단위로 정규화된 FRET 이미지가 여기에 표시됩니다. 쥐 간 렉틴의 RHL1 및 2는 원형질막의 세포질 쪽에 GFP 및 체리로 표지되었습니다. GFP RHL1 및 체리 RHL2 및 GFP RHL1 델타 스톡 및 체리 RHL2를 발현하는 세포의 평균 세포 FRET 효율은 수용체 대 기증자 분자 비율에 대해 표시됩니다.
제시된 정량적 FRET 접근 방식은 다음을 허용합니다. 살아있는 세포의 생리학적 맥락에서 단백질 상호작용의 검출. 시간 경과에 따른 단백질 상호 작용의 변화.
세포 내 구획의 상호 작용에서 공초점 이미지의 픽셀 수준별 차이. 및 살아있는 세포에서 발현되는 분자 수용체 대 공여체 비율에 대한 검출된 FRET 신호의 의존성.
