通过病毒样颗粒（"纳米刀片"）在永生化和原代细胞中递送Cas9 / sgRNA核糖核蛋白复合物

纳米刀片允许快速，高效和剂量依赖性地递送Cas9和引导RNA复合物，无论是在永生细胞中还是在原代细胞中，并且在没有抗转基因的情况下。该方法的主要优点是纳米刀片易于制备且相对便宜。它们可以以剂量依赖性和瞬态方式递送Cas9并引导RNA复合物，从而限制脱靶效应，同时允许有效的基因组编辑。

纳米刀片的制备方案非常简单。然而，生产者细胞的质量，以及它们的起源和转染前的接种，对于获得高产量的病毒样颗粒至关重要。演示该程序的将是我实验室的工程师Laura Guiguettaz。

第一天，在10厘米的细胞培养皿中，将350万至400万HEK 293T细胞接种在10毫升改良的DMEM和青霉素链霉素中。24小时后，当细胞达到70%汇合度时，用新鲜的DMEM替换培养基，并使用P-1000移液管以滴滴方式加入转染试剂溶液。在第四天，通过用10毫升移液管收集培养基上清液开始收获纳米刀片。

在此阶段，培养基的颜色变为黄色是正常的。将收集的上清液以500G离心五分钟以除去细胞碎片，并在不干扰细胞沉淀的情况下回收九毫升的上清液。在209，490 G的超速离心机中以4摄氏度沉淀纳米叶片75分钟。

离心后，缓慢吸出培养基并用100微升冷PBS重悬白色沉淀。用胶片盖住管子，在四摄氏度下孵育一小时，轻轻搅拌。然后，通过上下移液再次重悬沉淀。

在PBS中制备10%蔗糖溶液，并通过0.2微米注射器过滤器过滤。将2.5毫升10%蔗糖放入超速离心管中。倾斜试管，用低速移液器缓慢加入9毫升含VLP的样品，同时逐渐将试管提升到垂直位置。

将试管放入转子桶中，然后在4摄氏度下以209，490 G离心样品90分钟。离心后，小心地取出上清液，并将管倒置在薄纸上以除去任何残留的液体。为了教学目的和病毒沉淀的更好可视化，可以制备装有荧光蛋白mCherry的纳米片。

一分钟后，加入100微升PBS。将带有parafilm盖的管子放在管架上的搅拌台上，在四摄氏度下放置一小时，然后通过上下移液来重悬沉淀。通过在四体积PBS中加入一体积的含有非离子表面活性剂的裂解缓冲液来制备稀释缓冲液。

将两微升浓缩纳米叶片稀释在50微升的稀释缓冲液中，并短暂涡旋。将25微升的混合物转移到含有25微升稀释缓冲液的新管中，并重复该过程以获得六管纳米刀片稀释液。通过将2微升重组Cas9核酸酶加入50微升稀释缓冲液中，短暂涡旋，并进行八次连续稀释，进行标准对照。

用多通道移液管将每个VLP稀释液的2.5微升和每种标准品的2.5微升细点在硝酸纤维素膜上。一旦颗粒被吸收，用TBST在室温下补充5%脱脂奶粉阻断膜45分钟。丢弃TBST，用Cas9辣根过氧化物酶抗体在4摄氏度下孵育膜过夜。

用TBST洗涤膜三次，并使用增强型化学发光底物试剂盒可视化信号。对于用纳米片转导靶细胞，用含有纯化纳米片的500微升培养基替换细胞培养基。在细胞孵育四到六小时后，将培养基更换为正常量的新鲜培养基。

在该协议中，在转染当天接种细胞以70%至80%汇合的均匀分布，形成合胞体，导致24小时后具有多个细胞核的较大细胞。转染后40小时，大多数细胞形成合胞体并开始从板中分离。使用硝酸纤维素膜上的点印迹定量纳米片内加载的Cas9量，与参考重组Cas9相比，其显示出增强的化学发光。

绘制了重组Cas9稀释液的量化化学发光信号与已知Cas9量的校准曲线。然后，绘制每个纳米叶片制备中的Cas9蛋白浓度，揭示不同批次的不同Cas9浓度。T7内切酶测定表明，纳米叶片的效率可以因批次而异。

例如，观察到一个批次的总体编辑效率为20%，而另一个批次显示效率为60%。使用抗旗琼脂糖珠对Flag-DDX3蛋白进行免疫沉淀，然后使用抗标志抗体对回收的蛋白质进行蛋白质印迹分析。PCR还使用插入位点两侧的引物或标记插入位点下游的DDX3位点特异性正向和反向引物，通过PCR测定标记在DDX3位点中的位点导向插入。

重要的是将细胞放置在正确的汇合处，并获得细胞的均匀分布。在纳米刀片离心后，重悬沉淀并获得浓缩病毒颗粒的均匀样品也很重要。纳米刀片使科学家能够通过递送Cas9来研究双链DNA断裂修复的机制，并以快速协调的方式将RNA复合物引导到特定的基因组位点。

它们还使得在先天免疫系统的原代细胞中灭活长的非编码RNA成为可能，以研究它们的作用。