Os nanoblades permitiram a entrega rápida, eficiente e dependente de doses do complexo Cas9 e guiar o RNA, tanto em células imortalizadas quanto em células primárias, e na ausência de anti-transgene. A principal vantagem deste método é que os nanoblados são fáceis e relativamente baratos de se preparar. Eles podem entregar o Cas9 e guiar o complexo de RNA de forma dependente de dose e transitória, limitando assim os efeitos fora do alvo, permitindo a edição eficiente do genoma.
O protocolo de preparação para nanoblades é muito simples. No entanto, a qualidade das células produtoras, bem como sua origem e sua semeação antes da transfecção, são essenciais para obter altos rendimentos de partículas semelhantes a vírus. Demonstrando o procedimento estará Laura Guiguettaz, engenheira do meu laboratório.
No primeiro dia, sementes 3,5 a 4 milhões de células HEK 293T em 10 mililitros de DMEM modificados e estreptomicina penicilina em um prato de cultura celular de 10 centímetros. Após 24 horas, quando as células atingirem 70% de confluência, substitua o meio por DMEM fresco e use uma pipeta P-1000 para adicionar solução de reagente de transfecção de forma em gota. Comece a colher nanobladas no quarto dia coletando o supernanato médio da cultura com uma pipeta de 10 mililitros.
É normal que a cor do meio cultural se transforme em amarelo nesta fase. Centrifugar o supernante coletado a 500 G por cinco minutos para remover detritos celulares, e recuperar nove mililitros do supernatante sem perturbar a pelota celular. Pellte os nanoblades em um ultracentrifuuge a 209, 490 G por 75 minutos a quatro graus Celsius.
Após a centrifugação, aspire lentamente o meio e resuspenque a pelota branca com 100 microliters de PBS frio. Cubra o tubo com parafilm e incubar por uma hora a quatro graus Celsius com agitação suave. Em seguida, resuspense a pelota novamente, pipetting para cima e para baixo.
Prepare uma solução de 10% de sacarose em PBS e filtre-a através de um filtro de seringa de 0,2 micrômetro. Coloque 2,5 mililitros de 10% de sacarose em um tubo ultracentrífuga. Incline o tubo e adicione lentamente os nove mililitros da amostra contendo VLP com uma pipeta de baixa velocidade enquanto eleva progressivamente o tubo para uma posição vertical.
Coloque tubos nos baldes de rotor, depois centrifufique as amostras a 209, 490 G por 90 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenatante cuidadosamente e coloque o tubo de cabeça para baixo no papel de tecido para remover qualquer líquido restante. Para fins didáticos e melhor visualização da pelota viral, nanoblades carregados com a proteína fluorescente mCherry podem ser preparados.
Após um minuto, adicione 100 microliters de PBS. Coloque o tubo com uma tampa de parafilm em um suporte de tubo em uma mesa de agitação por uma hora a quatro graus Celsius, e resuspenque a pelota pipeta para cima e para baixo. Prepare o tampão de diluição adicionando um volume de tampão de lise contendo um surfactante não iônico em quatro volumes de PBS.
Diluir dois microliters de nanoblados concentrados em 50 microliters de tampão de diluição e vórtice brevemente. Transfira 25 microliters da mistura para um novo tubo contendo 25 microliters de tampão de diluição e repita o procedimento para ter seis tubos de diluições de nanoblade. Faça o controle padrão adicionando dois microliters de nuclease Cas9 recombinante em 50 microliters de tampão de diluição, vórtice brevemente, e fazer oito diluições seriais.
Detectar 2,5 microliters de cada diluição VLP, e 2,5 microliters de cada padrão em uma membrana nitrocelulose cuidadosamente com uma pipeta multicanal. Uma vez absorvidas as partículas, bloqueie a membrana com TBST suplementada com leite seco de 5% sem gordura por 45 minutos em temperatura ambiente. Descarte o TBST e incubar a membrana durante a noite a quatro graus Celsius com o anticorpo peroxidase de rabanete Cas9.
Lave a membrana três vezes com TBST e visualize o sinal usando um kit de substrato de chemiluminescente aprimorado. Para transdução de células-alvo por nanoblados, substitua o meio de cultura celular por 500 microlitres do meio contendo nanobladas purificadas. Após quatro a seis horas de incubação celular, substitua o meio à quantidade normal de meio fresco.
No protocolo, as células foram semeadas para distribuição homogênea com confluência de 70 a 80% no dia da transfecção, formando sincronia levando a células maiores com múltiplos núcleos após 24 horas. 40 horas após a transfecção, a maioria das células formaram sincronia e começaram a se desprender da placa. A quantidade de Cas9 carregada dentro de nanoblades foi quantificada usando uma mancha de ponto em uma membrana nitrocelulose, que exibiu quimiominascência aprimorada em comparação com a referência recombinante Cas9.
Uma curva de calibração foi traçada para o sinal de quimiominascência quantificada para diluições cas9 recombinantes contra a quantidade conhecida de Cas9. Em seguida, foi mapeada a concentração de proteínas Cas9 em cada preparação de nanoblade, revelando diferentes concentrações de Cas9 de lote em lote. O ensaio endonuclease T7 demonstrou que a eficiência dos nanoblades pode diferir de lote para lote.
Por exemplo, observou-se que um lote tinha 20% de eficiência de edição global, enquanto o outro lote apresentava 60% de eficiência. As proteínas flag-DDX3 foram imuno-precipitadas usando contas anti-bandeira agarose, seguidas pela análise ocidental das proteínas recuperadas usando um anticorpo anti-bandeira. A inserção direcionada ao local da tag de bandeira no lócus DDX3 também foi avaliada pelo PCR usando primers flanqueando o local de inserção, ou primers avançados e invertidos específicos do lócus DDX3 a jusante do local de inserção da bandeira.
É importante colocar as células em uma confluência correta, e obter uma distribuição uniforme das células. Após a centrifugação de nanoblade, também é importante resuspensar a pelota e obter uma amostra homogênea de partículas virais concentradas. Os nanoblades permitiram que os cientistas estudassem o mecanismo de reparação de quebra de DNA de dupla fita, fornecendo o Cas9 e guiando o complexo de RNA para loci genômica específica de forma rápida e coordenada.
Eles também permitiram inativar RNAs de longa não codificação em células primárias do sistema imunológico inato, a fim de estudar seu papel.
