Нанолезвища позволили быстро, эффективно и дозозависимо доставлять cas9 и направляющий комплекс РНК как в увековеченные, так и в первичные клетки, а также при отсутствии антитрансгена. Основным преимуществом этого метода является то, что нанолезвия просты и относительно недороги в приготовлении. Они могут доставлять Cas9 и направлять комплекс РНК дозозависимым и переходным образом, тем самым ограничивая нецелевые эффекты, обеспечивая при этом эффективное редактирование генома.
Протокол приготовления нанолезв очень прост. Однако качество клеток-продуцентов, а также их происхождение и их посев перед трансфекцией имеют важное значение для получения высоких урожаев вирусоподобных частиц. Продемонстрировать процедуру будет Лаура Гигеттас, инженер из моей лаборатории.
В первый день посейте от 3,5 до 4 миллионов клеток HEK 293T в 10 миллилитрах модифицированного DMEM и пенициллина стрептомицина в 10-сантиметровой чашке для культивирования клеток. Через 24 часа, когда клетки достигнут 70% конфюляции, замените среду свежим DMEM и используйте пипетку P-1000, чтобы добавить раствор трансфекционного реагента по каплям. Начните собирать нанобелки на четвертый день, собрав супернатант питательной среды с помощью 10-миллилитровой пипетки.
Нормально, что цвет питательной среды на этом этапе становится желтым. Центрифугируйте собранный супернатант при 500 G в течение пяти минут, чтобы удалить клеточный мусор, и восстановите девять миллилитров супернатанта, не нарушая клеточную гранулу. Гранулируйте нанобелки в ультрацентрифуге при 209, 490 Г в течение 75 минут при четырех градусах Цельсия.
После центрифугирования медленно аспирируйте среду и повторно суспендируйте белую гранулу 100 микролитрами холодного PBS. Накройте тюбик парапленкой и высиживайте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия с мягким перемешиванием. Затем повторно суспендируйте гранулу снова, пипеткой вверх и вниз.
Приготовьте 10%-ный раствор сахарозы в PBS и процедите его через 0,2-микрометровый шприцевой фильтр. Поместите 2,5 миллилитра 10% сахарозы в ультрацентрифужную трубку. Наклоните трубку и медленно добавьте девять миллилитров VLP-содержащего образца с помощью низкоскоростной пипетки, постепенно поднимая трубку в вертикальное положение.
Поместите трубки в ведра ротора, затем центрифугируйте образцы при 209, 490 G в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования осторожно удалили супернатант и поместили трубку вверх ногами на папиросную бумагу, чтобы удалить оставшуюся жидкость. Для дидактических целей и лучшей визуализации вирусной гранулы могут быть приготовлены нанолезвия, загруженные флуоресцентным белком mCherry.
Через минуту добавьте 100 микролитров PBS. Поместите трубку с крышкой из парапленки в держатель трубки на стол для перемешивания в течение одного часа при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируйте гранулу путем пипетки вверх и вниз. Подготовьте буфер разбавления, добавив один объем буфера лизиса, содержащего неионное поверхностно-активное вещество в четырех объемах PBS.
Разбавьте два микролитра концентрированных нанолезвей в 50 микролитрах буфера разбавления и вихря ненадолго. Переложите 25 микролитров смеси в новую трубку, содержащую 25 микролитров буфера разбавления, и повторите процедуру, чтобы иметь шесть пробирок разведения нанолезвий. Сделайте стандартное управление, добавив два микролитра рекомбинантной нуклеазы Cas9 в 50 микролитров буфера разбавления, кратковременно вихрьте его и сделайте восемь последовательных разведений.
Осторожно нанесите 2,5 микролитра каждого разведения VLP и 2,5 микролитра каждого стандарта на нитроцеллюлозную мембрану с помощью многоканальной пипетки. Как только частицы впитаются, заблокируйте мембрану TBST, дополненным 5% обезжиренным сухим молоком в течение 45 минут при комнатной температуре. Откажитесь от TBST и инкубируйте мембрану в течение ночи при четырех градусах Цельсия с антителом к пероксидазе хрена Cas9.
Трижды промойте мембрану с помощью TBST и визуализируйте сигнал с помощью улучшенного набора хемилюминесцентной подложки. Для трансдукции клеток-мишеней нанолопастями замените среду клеточной культуры 500 микролитрами среды, содержащей очищенные нанобелки. После четырех-шести часов инкубации клеток замените среду до нормального количества свежей среды.
В протоколе клетки были посеяны для однородного распределения с 70-80% конфюляцией в день трансфекции, образуя синцитию, приводящую к более крупным клеткам с несколькими ядрами через 24 часа. Через 40 часов после трансфекции большинство клеток образовали синцитию и начали отсоединяться от пластины. Количество Cas9, загруженного в нанолезвиях, было количественно определено с использованием точечного пятна на нитроцеллюлозной мембране, которое показало улучшенную хемилюминесценцию по сравнению с эталонным рекомбинантным Cas9.
Калибровочная кривая была построена для количественного сигнала хемилюминесценции для рекомбинантных разбавлений Cas9 против известного количества Cas9. Затем была нанесена на карту концентрация белка Cas9 в каждом препарате нанобелков, что выявило различные концентрации Cas9 от партии к партии. Анализ эндонуклеазы Т7 показал, что эффективность нанолезв может отличаться от партии к партии.
Например, было отмечено, что одна партия имеет 20% общую эффективность редактирования, в то время как другая партия показала эффективность 60%. Белки Flag-DDX3 были иммуноосаждены с использованием антифлаговых агарозных шариков, после чего был проведен анализ восстановленных белков с использованием антифлагового антитела. Направленная на сайт вставка тега флага в локус DDX3 также анализировалась с помощью ПЦР с использованием либо праймеров, фланкирующих место вставки, либо прямых и обратных грунтовок, характерных для локуса DDX3 ниже по течению от места вставки флага.
Важно разместить клетки при правильном слиянии, и получить равномерное распределение клеток. При центрифугировании нанолезвища также важно повторно суспендировать гранулу и получить однородный образец концентрированных вирусных частиц. Нанолезвия позволили ученым изучить механизм восстановления двухцепочечного разрыва ДНК, быстро и скоординированно доставляя комплекс Cas9 и направляя РНК в конкретные геномные локусы.
Они также позволили инактивировать длинные некодирующие РНК в первичных клетках врожденной иммунной системы с целью изучения их роли.
