나노 블레이드는 Cas9및 가이드 RNA 복합체의 신속하고 효율적이며 용량 의존적 전달을 허용했으며, 불멸과 1 차 세포에서, 그리고 항 트랜스유전자가 없는 경우. 이 방법의 주요 장점은 나노 블레이드가 쉽게 비교적 저렴하여 준비하는 것이 중요하다는 것입니다. 그(것)들은 Cas9를 전달하고 복용량 의존적이고 일시적인 방식으로 RNA 복합체를 안내할 수 있습니다, 따라서 효율적인 게놈 편집을 허용하면서, 오프 표적 효력을 제한합니다.
나노 블레이드에 대한 준비 프로토콜은 매우 간단합니다. 그러나, 바이러스와 같은 입자의 높은 수율을 얻기 위하여 생산자 세포의 질, 뿐만 아니라 그들의 기원 및 그들의 종자, 필수적이다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 엔지니어 인 로라 기게타즈 (Laura Guiguettaz)가 될 것입니다.
첫날, 10센티미터 세포 배양 접시에서 변형된 DMEM 및 페니실린 연쇄절제술기의 10밀리리터에서 3.5~400만 HEK 293T 세포를 종자 3.5~400만 개의 HEK 293T 세포. 24시간 후, 세포가 70%에 도달하면 배지를 신선한 DMEM으로 대체하고 P-1000 파이펫을 사용하여 낙하 방향으로 트랜스펙트 시약 용액을 추가합니다. 10 밀리리터 파이펫으로 배양 배지 상수체를 수집하여 4일째에 나노블레이드를 수확하기 시작합니다.
이 단계에서 배양 매체의 색상이 노란색으로 변하는 것은 정상입니다. 수집된 상체를 500G에서 5분간 원심분리하여 셀룰러 이물질을 제거하고, 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄의 9밀리리터를 회수한다. 209에서 초원심분리기의 나노 블레이드를 펠릿, 섭씨 4도에서 75 분 동안 490 G.
원심 분리 후, 천천히 매체를 흡인하고 차가운 PBS의 100 마이크로 리터와 흰색 펠릿을 다시 중단. 파라필름으로 튜브를 덮고 섭씨 4도에서 1시간 동안 부드러운 교반으로 배양합니다. 그런 다음, 위아래로 피펫을 하여 펠릿을 다시 다시 놓습니다.
PBS에서 10% 자당 용액을 준비하고 0.2 마이크로미터 주사기 필터를 통해 필터링합니다. 10%의 2.5 밀리리터를 초원심분리기 튜브에 넣습니다. 튜브를 기울이고 천천히 수직 위치로 튜브를 올리는 동안 저속 파이펫으로 VLP 함유 샘플의 9 밀리리터를 추가합니다.
로터 버킷에 튜브를 놓고 샘플을 209, 섭씨 4도에서 90분 동안 490G에서 원심분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 조심스럽게 제거하고 튜브를 티슈 페이퍼에 거꾸로 올려 놓고 남은 액체를 제거했습니다. 교훈적 목적과 바이러스 성 펠릿의 더 나은 시각화를 위해 형광 단백질 mCherry로로드 된 나노 블레이드를 제조 할 수 있습니다.
1분 후 PBS 의 마이크로리터 100개를 추가합니다. 튜브홀더에 1시간 동안 섭씨 4도의 튜브 홀더를 놓고 위아래로 파이프를 통해 펠릿을 재놓습니다. PBS의 4부권에 비이온 계면활성제를 포함하는 용해 버퍼 의 한 부피를 추가하여 희석 버퍼를 준비한다.
희석 완충제와 소용돌이의 50 마이크로 리터에 농축 나노 블레이드의 두 마이크로 리터를 간단히 희석. 25 마이크로리터의 희석 완충제를 포함하는 새로운 튜브로 혼합물25 마이크로리터를 옮기고 6개의 나노블레이드 희석튜브를 갖는 절차를 반복한다. 재조합 Cas9 뉴클레아제 의 2개의 마이크로리터를 희석 완충제 50 마이크로리터에 추가하여 표준 제어를 하고, 잠시 소용돌이를 만들고, 8개의 시리얼 희석제를 만듭니다.
각 VLP 희석제의 2.5 마이크로리터와 각 표준의 2.5 마이크로리터를 멀티채널 파이펫으로 니트로셀룰로오스 멤브레인에 조심스럽게 배치합니다. 입자가 흡수되면 실온에서 45 분 동안 5 % 무지방 건조 우유로 보충 된 TBST로 멤브레인을 차단하십시오. TBST를 버리고 Cas9 고추냉이 과록시다제 항체로 밤새 4도에서 멤브레인을 배양하십시오.
TBST로 멤브레인을 세 번 세척하고 향상된 화학 발광 기판 키트를 사용하여 신호를 시각화합니다. 표적 세포를 나노블레이드로 변환하기 위해 세포 배양 배지를 정제 된 나노 블레이드를 포함하는 배지의 500 마이크로 리터로 대체하십시오. 4~6시간의 세포 배양을 한 후, 배지를 상시 양의 신선한 배지로 바꿉다.
프로토콜에서, 세포는 24 시간 후에 다중 핵을 가진 더 큰 세포로 이끌어 내는 동기화를 형성하는 transfection의 날에 70 80%의 합류와 동질성 분포를 위해 종자되었습니다. 40 회광 후, 대부분의 세포는 싱크를 형성하고 플레이트에서 분리하기 시작했다. 나노 블레이드 내에적재된 Cas9의 양은 니트로셀룰로오스 멤브레인에 도트 블롯을 사용하여 정량화되었으며, 이는 참조 재조합 Cas9에 비해 향상된 케미발광을 나타냈다.
Ca9의 알려진 양에 대해 재조합 Cas9 희석에 대한 정량화된 화학 발광 신호에 대한 보정 곡선이 플롯되었습니다. 이어서, 각 나노블레이드 제제에서 Cas9 단백질 농도를 매핑하여 배치에서 배치까지 Cas9의 다양한 농도를 드러냈습니다. T7 엔도누칼 분석은 나노 블레이드의 효율성이 배치마다 다를 수 있음을 입증했습니다.
예를 들어, 한 배치는 전체 편집 효율이 20%인 반면 다른 배치는 60%의 효율을 표시하는 것으로 관찰되었습니다. 플래그-DDX3 단백질은 항플래그 아가로즈 구슬을 사용하여 면역침전을 했고, 이어서 항플래그 항체를 사용하여 회수된 단백질의 서양 얼룩 분석이 뒤따랐다. DDX3 궤적에서 플래그 태그의 사이트 지향 삽입은 삽입 부위 측면의 프라이머 또는 플래그 삽입 부위의 DDX3 로커스 하류에 특정한 전방 및 역 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 분석되었다.
세포를 올바른 합류에 배치하고 세포의 균등한 분포를 얻는 것이 중요합니다. 나노 블레이드 원심 분리시, 펠릿을 다시 중단하고 농축 된 바이러스 입자의 균일 한 샘플을 얻는 것도 중요합니다. 나노 블레이드는 과학자들이 Cas9를 제공함으로써 이중 좌초 된 DNA 브레이크 수리 메커니즘을 연구하고 RNA 복합체를 신속하고 조정 된 방식으로 특정 게놈 궤적로 안내 할 수있게했습니다.
그(것)들은 또한 그들의 역할을 공부하기 위하여 선천적인 면역 계통의 1 차적인 세포에 있는 긴 비코딩 RNA를 비활성화하는 가능하게 했습니다.
