ナノブレードは、不死化細胞および初代細胞の両方において、および抗導入遺伝子の非存在下で、Cas9およびガイドRNA複合体の迅速、効率的、かつ用量依存的な送達を可能にした。この方法の主な利点は、ナノブレードが調製が容易で比較的安価であることです。それらは、Cas9を送達し、RNA複合体を用量依存的かつ一過性の方法で誘導することができ、したがって、効率的なゲノム編集を可能にしながら、オフターゲット効果を制限することができる。
ナノブレードの準備プロトコルは非常に簡単です。しかし、産生細胞の品質、ならびにそれらの起源およびトランスフェクション前の播種は、ウイルス様粒子を高収率で得るために不可欠である。手順を実演するのは、私の研究室のエンジニアであるLaura Guiguettazです。
初日に、10センチメートルの細胞培養皿に10ミリリットルの改変DMEMおよびペニシリンストレプトマイシンに350万〜400万個のHEK 293T細胞を播種する。24時間後、細胞が70%コンフルエントに達したら、培地を新鮮なDMEMと交換し、P-1000ピペットを使用してトランスフェクション試薬溶液を滴下して加える。4日目にナノブレードの採取を開始するには、培養液上清を10ミリリットルのピペットで回収します。
この段階で培養液の色が黄色に変わるのは正常です。回収した上清を500Gで5分間遠心分離して細胞破片を除去し、細胞ペレットを乱すことなく9ミリリットルの上清を回収した。ナノブレードを209、490Gの超遠心分離機で摂氏4度で75分間ペレット化する。
遠心分離後、培地をゆっくりと吸引し、白色ペレットを100マイクロリットルの冷たいPBSで再懸濁する。チューブをパラフィルムで覆い、穏やかな攪拌で摂氏4度で1時間インキュベートする。その後、ペレットを上下にピペッティングして再度懸濁させる。
PBS中の10%スクロース溶液を調製し、0.2マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過する。2.5ミリリットルの10%スクロースを超遠心管に入れます。チューブを傾け、チューブを徐々に垂直位置まで持ち上げながら、低速ピペットで9ミリリットルのVLP含有サンプルをゆっくりと加えます。
チューブをローターバケットに入れ、サンプルを209、490 Gで摂氏4度で90分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に取り出し、チューブをティッシュペーパーの上に逆さまに置き、残りの液体を除去した。教訓的な目的とウイルスペレットのより良い視覚化のために、蛍光タンパク質mCherryをロードしたナノブレードを調製することができる。
1分後、100マイクロリットルのPBSを加える。パラフィルムカバー付きのチューブを攪拌テーブル上のチューブホルダーに摂氏4度で1時間置き、ペレットを上下にピペッティングして再懸濁します。4倍量のPBSに非イオン性界面活性剤を含む溶解緩衝液を1倍量加えて希釈緩衝液を調製する。
2マイクロリットルの濃縮ナノブレードを50マイクロリットルの希釈緩衝液で希釈し、ボルテックスで短時間希釈する。25マイクロリットルの混合物を25マイクロリットルの希釈緩衝液を含む新しいチューブに移し、ナノブレード希釈の6本のチューブを有するように手順を繰り返す。50マイクロリットルの希釈バッファーに2マイクロリットルの組換えCas9ヌクレアーゼを加え、それを短時間ボルテックスし、8つの段階希釈を行うことによって、標準対照を作る。
各VLP希釈液の2.5マイクロリットル、および各標準液の2.5マイクロリットルをマルチチャンネルピペットでニトロセルロース膜上に注意深くスポットします。粒子が吸収されたら、TBSTに5%の脱脂粉乳を室温で45分間補充して膜をブロックします。TBSTを廃棄し、Cas9西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体と共に膜を摂氏4度で一晩インキュベートする。
TBSTでメンブレンを3回洗浄し、強化された化学発光基質キットを使用してシグナルを視覚化します。ナノブレードによる標的細胞の形質導入のために、細胞培養培地を精製ナノブレードを含む500マイクロリットルの培地と交換する。細胞インキュベーションの4〜6時間後、培地を通常の量の新鮮な培地に交換する。
プロトコールでは、トランスフェクションの日に細胞を70〜80%のコンフルエントで均質な分布のために播種し、24時間後に複数の核を有するより大きな細胞につながる合胞体を形成した。トランスフェクションの40時間後、ほとんどの細胞がシンシチアを形成し、プレートから剥離し始めた。ナノブレード内に装填されたCas9の量をニトロセルロース膜上のドットブロットを用いて定量し、これは、参照組換えCas9と比較して増強された化学発光を示した。
既知量のCas9に対する組換えCas9希釈物についての定量化された化学発光シグナルについて検量線をプロットした。次に、各ナノブレード調製物中のCas9タンパク質濃度をマッピングし、バッチごとに異なる濃度のCas9を明らかにした。T7エンドヌクレアーゼアッセイは、ナノブレードの効率がバッチごとに異なる可能性があることを実証した。
たとえば、1つのバッチは全体的な編集効率が20%で、もう1つのバッチは60%の効率を示すことが観察されました。Flag−DDX3タンパク質を抗フラグアガロースビーズを用いて免疫沈降させ、続いて抗フラグ抗体を用いて回収したタンパク質のウェスタンブロット分析を行った。DDX3遺伝子座におけるフラグタグの部位特異的挿入も、挿入部位に隣接するプライマー、またはフラグ挿入部位の下流のDDX3遺伝子座に特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれかを用いたPCRによってアッセイされた。
細胞を正しい合流点に置き、細胞の均一な分布を得ることが重要です。ナノブレード遠心分離に際し、ペレットを再懸濁し、濃縮ウイルス粒子の均質なサンプルを得ることも重要である。ナノブレードにより、科学者はCas9を送達し、RNA複合体を特定のゲノム遺伝子座に迅速かつ協調的に導くことによって、二本鎖DNA切断修復のメカニズムを研究することができました。
彼らはまた、自然免疫系の初代細胞で長いノンコーディングRNAを不活性化し、その役割を研究することを可能にしました。
