Le nanolame hanno permesso la consegna rapida, efficiente e dose-dipendente del complesso Cas9 e dell'RNA guida, sia nelle cellule immortalizzate che in quelle primarie, e in assenza di anti-transgene. Il vantaggio principale di questo metodo è che le nanolame sono facili e relativamente economiche da preparare. Possono fornire il cas9 e guidare il complesso di RNA in modo dose-dipendente e transitorio, limitando così gli effetti fuori bersaglio, consentendo al contempo un efficiente editing del genoma.
Il protocollo di preparazione per le nanolame è molto semplice. Tuttavia, la qualità delle cellule produttrici, così come la loro origine e la loro semina prima della trasfezione, sono essenziali per ottenere alte rese di particelle simili a virus. A dimostrare la procedura sarà Laura Guiguettaz, ingegnere del mio laboratorio.
Il primo giorno, semina da 3,5 a 4 milioni di cellule HEK 293T in 10 millilitri di DMEM modificato e penicillina streptomicina in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri. Dopo 24 ore, quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza, sostituire il mezzo con DMEM fresco e utilizzare una pipetta P-1000 per aggiungere la soluzione di reagente di trasfezione in modo a goccia. Inizia a raccogliere nanolame il quarto giorno raccogliendo il surnatante del terreno di coltura con una pipetta da 10 millilitri.
È normale che il colore del terreno di coltura si trasformi in giallo in questa fase. Centrifugare il surnatante raccolto a 500 G per cinque minuti per rimuovere i detriti cellulari e recuperare nove millilitri del surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Pellet le nanolame in un ultracentrifuga a 209, 490 G per 75 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, aspirare lentamente il mezzo e risospese il pellet bianco con 100 microlitri di PBS freddo. Coprire il tubo con parafilm e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione. Quindi, risospesciare nuovamente il pellet tubando su e giù.
Preparare una soluzione di saccarosio al 10% in PBS e filtrarla attraverso un filtro a siringa da 0,2 micrometri. Posizionare 2,5 millilitri di saccarosio al 10% in un tubo ultracentrifuga. Inclinare il tubo e aggiungere lentamente i nove millilitri di campione contenente VLP con una pipetta a bassa velocità mentre si solleva progressivamente il tubo in posizione verticale.
Posizionare i tubi nei secchi del rotore, quindi centrifugare i campioni a 209, 490 G per 90 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere accuratamente il surnatante e posizionare il tubo capovolto su carta velina per rimuovere il liquido rimanente. Per scopi didattici e una migliore visualizzazione del pellet virale, è possibile preparare nanolame caricate con la proteina fluorescente mCherry.
Dopo un minuto, aggiungere 100 microlitri di PBS. Posizionare il tubo con un coperchio parafilm in un supporto per tubi su un tavolo di agitazione per un'ora a quattro gradi Celsius e risospescere il pellet tubando su e giù. Preparare il tampone di diluizione aggiungendo un volume di tampone di lisi contenente un tensioattivo non ionico in quattro volumi di PBS.
Diluire brevemente due microlitri di nanolame concentrate in 50 microlitri di tampone di diluizione e vortice. Trasferire 25 microlitri della miscela in un nuovo tubo contenente 25 microlitri di tampone di diluizione e ripetere la procedura per avere sei tubi di diluizioni nanoblade. Effettuare il controllo standard aggiungendo due microlitri di nucleasi Cas9 ricombinante in 50 microlitri di tampone di diluizione, ruotarlo brevemente e fare otto diluizioni seriali.
Individuare 2,5 microlitri di ogni diluizione VLP e 2,5 microlitri di ogni standard su una membrana di nitrocellulosa con attenzione con una pipetta multicanale. Una volta assorbite le particelle, bloccare la membrana con TBST integrato con latte secco non grasso al 5% per 45 minuti a temperatura ambiente. Scartare il TBST e incubare la membrana durante la notte a quattro gradi Celsius con l'anticorpo Cas9 perossidasi di rafano.
Lavare la membrana tre volte con TBST e visualizzare il segnale utilizzando un kit di substrato chemiluminescente migliorato. Per la trasduzione di cellule bersaglio con nanolame, sostituire il terreno di coltura cellulare con 500 microlitri del mezzo contenenti nanolame purificate. Dopo quattro-sei ore di incubazione cellulare, sostituire il mezzo alla normale quantità di mezzo fresco.
Nel protocollo, le cellule sono state seminate per una distribuzione omogenea con una confluenza dal 70 all'80% il giorno della trasfezione, formando sincizia che porta a cellule più grandi con nuclei multipli dopo 24 ore. 40 ore dopo la trasfezione, la maggior parte delle cellule ha formato sincizia e ha iniziato a staccarsi dalla piastra. La quantità di Cas9 caricata all'interno di nanolame è stata quantificata utilizzando un dot blot su una membrana di nitrocellulosa, che ha mostrato una chemiluminescenza migliorata rispetto al Cas9 ricombinante di riferimento.
È stata tracciata una curva di calibrazione per il segnale di chemiluminescenza quantificato per le diluizioni Cas9 ricombinanti rispetto alla quantità nota di Cas9. Quindi, è stata mappata la concentrazione della proteina Cas9 in ogni preparazione nanoblade, rivelando diverse concentrazioni di Cas9 da lotto a lotto. Il test dell'endonucleasi T7 ha dimostrato che l'efficienza delle nanolame può differire da lotto a lotto.
Ad esempio, è stato osservato che un batch ha un'efficienza di modifica complessiva del 20%, mentre l'altro batch ha mostrato un'efficienza del 60%. Le proteine Flag-DDX3 sono state immuno-precipitate utilizzando perline di agarosio anti-flag, seguite dall'analisi Western blot delle proteine recuperate utilizzando un anticorpo anti-flag. Anche l'inserimento diretto al sito del tag flag nel locus DDX3 è stato analizzato mediante PCR utilizzando primer che fiancheggiano il sito di inserimento o primer avanti e indietro specifici per il locus DDX3 a valle del sito di inserimento della bandiera.
È importante posizionare le cellule ad una corretta confluenza e ottenere una distribuzione uniforme delle cellule. Dopo la centrifugazione a nanolame, è anche importante risospese il pellet e ottenere un campione omogeneo di particelle virali concentrate. Le nanolame hanno permesso agli scienziati di studiare il meccanismo di riparazione della rottura del DNA a doppio filamento consegnando il complesso Cas9 e RNA guida a specifici loci genomici in modo rapido e coordinato.
Hanno anche permesso di inattivare lunghi RNA non codificanti nelle cellule primarie del sistema immunitario innato al fine di studiarne il ruolo.
