行为小鼠希波坎帕的神经元活动可视化的颅骨切除术

嘿，伙计们，我叫王阳东，我来自西湖大学的基里尔·皮亚特克维奇分子生物工程实验室。今天，我要告诉你在小鼠体内成像海马体神经元活动的程序。打开焊接机，加热到所需的温度。

使用帮助手调整成像管和注射管的位置，如图所示。使用注射器与针头，将少量适当的通量涂在成像和注射管之间的连接点上五秒钟，然后去除液滴。安装焊接锡，并将其应用到随通量处理的连接点。

避免过量焊接锡，因为它将需要不必要的更大的颅骨，使手术期间。等待焊接锡冷却。通常，它需要几秒钟。

确认注射管不会通过从两个方向插入假管来阻止。使用牙签或 26 口径注射器针在成像管底部应用紫外线固化光学胶粘剂。使用细钳小心放置与成像管相当大小的盖玻璃。

通过标准手持式紫外线灯的紫外线照明，将胶粘剂固化至少一小时。根据 IACUC 批准的程序，用异氟素麻醉鼠标。将鼠标置于手术加热垫上的立体氧化框架中。

用耳栏固定头部。稍微将头部向四面八方推，以确保头部牢固固定。应用眼药膏，以防止动物的眼睛在手术过程中干涸。

使用修剪器或脱脂霜将毛皮从颈部后部移到眼睛。在切口之前，用β丁对手术部位进行消毒，然后三次使用70%乙醇消毒。取出头骨顶部的皮肤，从头部底部周围的水平切口开始，然后朝骨皮方向切开两处，几乎到达眼睑。

然后两个斜切，在中线收敛。用两个无菌棉签，收回连接组织，以及颈部后部到头骨边缘的肌肉。将一滴利多卡因溶液涂抹在围产层表面两分钟，以避免过度疼痛。

用手术刀轻轻刮伤头骨的整个暴露区域，形成干燥粗糙的表面。将针尖放在兰姆达上，看看 AP 坐标是否为零，以确认头部位置是垂直的，以及 ML 坐标是否为零，以确认头部水平定位。如果没有，调整立体塔的传动旋钮，直到AP和ML坐标都在0.1毫米以内。

移动针尖，找到颅骨切除术的相应点，并用精细的标记标记它们在头骨上的位置。根据四个标记点绘制一个圆，以及圆的管面注射管区域的轮廓。以每分钟 10，000 发子弹的速度使用气动钻头，沿着头骨上标记的轮廓轻轻钻取。

钻头骨，直到留下一层非常薄的骨头，通常开始在中心温柔的触摸下摆动。将一滴无菌 PBS 涂抹到颅骨切除术中心。用非常薄的倾斜钳子或两根26口径的针头从对面接近头骨，将骨瓣抬起来。

应用PBS后，通过26米钝针几次清洁杜拉表面。应用温和的吸力来消融皮层以及海马上方的科珀斯卡洛苏姆。皮层通常比科珀斯卡洛苏姆更黄。

科珀斯卡洛苏姆通常比海马宽。此外，当从顶部观察到科珀斯卡洛苏姆时，神经元纤维在垂直和水平方向上很容易区分。此时出血会影响颅骨切除术中脑组织的可见性。

应用 PBS，然后轻轻吸气，而你渴望皮层去除血液，科珀斯卡洛苏姆可以识别的白色纤维的方向，如示意图显示在图表中。通过在圆形运动中轻轻吸吸，将科珀斯卡洛苏姆纤维逐层去除。PBS 不断被应用，以摆脱在暴露的脑组织上方积累的血液。

轻轻地将植入物插入颅骨切除术。用 L 形针牢牢地按压植入物顶部，以尽可能靠近海马体的外露表面，使植入物的光学窗口位置尽可能接近。反复在植入物周围的疤痕上涂抹 PBS，然后在植入过程中尽可能吸去血液。

在植入物和头骨之间涂抹一层薄薄的快速密封，以防止牙齿水泥穿透头骨下。一旦快速密封固化，在头骨表面、快速密封表面和植入物表面均匀地应用超级键。一旦超级键被治愈，应用假牙基础树脂以上超级键，以及皮肤周围的切口在手术开始。

假牙碱脂固化后，将头板放在植入物周围的树脂上，使其与成像管一起集中。在头板周围和上方涂抹更多的假牙基树脂，以固定其位置。让它治愈几分钟。

避免在管子周围积筑一层厚厚的水泥，以确保更好地进入成像窗口是客观的镜头。稀释假牙基树脂以降低其粘度，从而使其能够填充与施用器难以触及的腔。轻轻地将绝缘橡胶胶带放在窗户上方，以保护窗户免受动物绑带可能造成的污染。

在病毒溶液中加入快速绿色染料库存溶液，在 PCR 管中以 1 比 9 的比例稀释到所需的滴定器。提取 600 纳米升的病毒溶液，取出假管，并将内部管连接到注射注射器中，放入导管中。以每分钟 15 纳米升的速度注入病毒，总共 10 分钟。

保持内部管连接10分钟，使病毒在窗口下传播。轻轻地从导管中取出内部管子，用假管重新回顾它。用4%异氟兰诱导鼠标几分钟。

将其头板固定在头部叉上，然后将头叉固定在跑步机上。使用低放大目标透镜来查找功能成像的最佳滤视图。然后，切换到更高的客观镜头，以单细胞分辨率记录神经元活动。

对于钙成像，绿色荧光灯是兴奋的市售470纳米LED使用标准的GFP过滤感。为了获得荧光痕迹，通过 ImageJ 软件手动分割和分析与神经元细胞质量相对应的兴趣区域。在近红外信道上使用 40 X 镜头光学电压记录进行电压成像，获取率为 830 赫兹。

自发神经活动记录持续长达25，000帧。在这里，我们描述了一种将海马体长期成像为行为小鼠A1区域的方法。该方法基于慢性植入。

现在定制的成像窗口，这也使病毒或药物的靶向管理直接对感兴趣的神经元。我们相信，上述协议将促进旨在利用简单且经济实惠的1光子成像设置，调查行为小鼠海马中空间时间分辨率高的神经元活动的研究。