Hey, Leute, mein Name ist Wang Yangdong, und ich komme von Dr. Kiryl Piatkevich molecular bio-engineering lab an der Westlake University. Heute werde ich Ihnen das Verfahren zur Abbildung neuronaler Aktivitäten des Hippocampus bei Mäusen in vivo zeigen. Schalten Sie das Schweißgerät ein und erhitzen Sie es auf die erforderliche Temperatur.
Passen Sie die Position der Bildkanüle und der Injektionskanüle mit helfenden Händen an, wie in der Abbildung gezeigt. Tragen Sie mit der Spritze mit der Nadel fünf Sekunden lang eine kleine Menge geeigneter Art von Flussmittel auf die Verbindungspunkte zwischen Bildgebung und Injektionskanüle auf und entfernen Sie dann den Tropfen. Lötzinn montieren und auf die mit dem Flussmittel behandelte Verbindungsstelle auftragen.
Vermeiden Sie überschüssiges Lötzinn, da es während der Operation unnötig größere Schädel erfordert. Warten Sie, bis die Lötdose abgekühlt ist. Normalerweise dauert es mehrere Sekunden.
Vergewissern Sie sich, dass die Injektionskanüle nicht blockiert ist, indem Sie die Dummy-Kanüle aus beiden Richtungen einführen. Tragen Sie uv-härtenden optischen Klebstoff mit einem Zahnstocher oder einer 26-Gauge-Spritzennadel auf die Unterseite der bildgebenden Kanüle auf. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um vorsichtig ein Deckglas der entsprechenden Größe auf die Bildkanüle zu legen.
Härten Sie den Klebstoff mindestens eine Stunde lang durch UV-Beleuchtung einer Standard-Handheld-UV-Lampe aus. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran nach IACUC-zugelassenem Verfahren. Platzieren Sie die Maus in einem stereotaxischen Rahmen über einem Operationsheizkissen.
Befestmen Sie den Kopf mit Ohrbügeln. Drücken Sie den Kopf leicht in alle Richtungen, um sicherzustellen, dass der Kopf fest gesichert ist. Tragen Sie Augensalbe auf, um zu verhindern, dass die Augen des Tieres während der Operation austrocknen.
Verwenden Sie einen Trimmer oder eine Enthaarungscreme, um das Fell vom Nacken bis zu den Augen zu entfernen. Sterilisieren Sie die Operationsstelle dreimal mit Betadin gefolgt von 70% Ethanol, bevor Sie einen Schnitt machen. Entfernen Sie die Haut über der Oberseite des Schädels, beginnend mit dem horizontalen Schnitt um die Basis des Kopfes, gefolgt von zwei Schnitten in Rostralrichtung, die fast die Augenlider erreichen.
Dann zwei schräge Schnitte, die an der Mittellinie zusammenlaufen. Ziehen Sie mit zwei sterilen Wattestäbchen das Verbindungsgewebe sowie die Muskulatur des Nackens bis zu den Schädelrändern zurück. Tragen Sie einen Tropfen Lidocainlösung für zwei Minuten auf die Oberfläche des Periosts auf, um übermäßige Schmerzen zu vermeiden.
Kratzen Sie vorsichtig den gesamten freiliegenden Bereich des Schädels mit einem Skalpell ab, um eine trockene und raue Oberfläche zu schaffen. Legen Sie die Nadelspitze auf den Lambda, um zu sehen, ob die AP-Koordinate Null ist, um zu bestätigen, dass die Kopfposition vertikal ist, sowie wenn die ML-Koordinate Null ist, um zu bestätigen, dass der Kopf horizontal positioniert ist. Wenn nicht, stellen Sie die entsprechenden Knöpfe an der stereotaxischen Station ein, bis die AP- und ML-Koordinaten beide innerhalb von 0,1 Millimetern liegen.
Bewegen Sie die Spitze der Nadel, um die entsprechenden Punkte für die Kraniotomie zu finden, und markieren Sie ihre Positionen auf dem Schädel mit einem feinen Marker. Zeichnen Sie einen Kreis basierend auf vier markierten Punkten sowie den Umriss des Injektionskanülenbereichs auf der Kanülenseite des Kreises. Verwenden Sie einen pneumatischen Bohrer mit einer Geschwindigkeit von 10.000 Schuss pro Minute, um sanft entlang des auf dem Schädel markierten Umrisses zu bohren.
Bohren Sie den Schädel, bis eine sehr dünne Knochenschicht übrig ist, die normalerweise unter sanfter Berührung in der Mitte zu wackeln beginnt. Tragen Sie einen Tropfen steriles PBS auf die Mitte der Kraniotomie auf. Heben Sie die Knochenklappe mit einer sehr dünnen Zange oder zwei 26-Gauge-Nadeln, die sich ihm von den gegenüberliegenden Seiten nähern, vom Schädel ab.
Tragen Sie PBS gefolgt von sanften Abungen mehrmals durch eine stumpfe Nadel mit 26 Gauge auf, um die Oberfläche der Dura zu reinigen. Wenden Sie sanftes Absaugen an, um den Kortex sowie das Corpus Callosum über dem Hippocampus abzutragen. Cortex ist oft gelber als der Corpus Callosum.
Und der Corpus Callosum ist in der Regel breiter als der Hippocampus. Außerdem ist das Corpus Callosum wirklich leicht durch neuronale Fasern zu unterscheiden, die in vertikaler und horizontaler Richtung gehen, wenn sie von oben beobachtet werden. Blutungen an diesem Punkt beeinflussen die Sichtbarkeit des Hirngewebes in der Kraniotomie.
Tragen Sie PBS auf, gefolgt von einem sanften Absaugen, während Sie den Kortex absaugen, um das Blut loszuwerden, Corpus Callosum kann an der Richtung der weißen Fasern erkannt werden, wie schematisch im Diagramm gezeigt. Entfernen Sie Corpus Callosum-Fasern Schicht für Schicht, indem Sie in einer kreisförmigen Bewegung sanftes Absaugen anwenden. PBS wird ständig angewendet, um Blut loszuwerden, das sich über exponiertem Hirngewebe ansammelt.
Setzen Sie das Implantat vorsichtig in die Kraniotomie ein. Drücken Sie mit der L-förmigen Nadel fest auf das Implantat, um das optische Fenster des Implantats so nah wie möglich an der freiliegenden Oberfläche des Hippocampus zu positionieren. Tragen Sie PBS wiederholt auf die Narbe um das Implantat herum auf, gefolgt von einer Absaugung, um während des Einsetzens des Implantats so weit wie möglich Blut zu entfernen.
Tragen Sie eine dünne Schicht schnell zwischen Implantat und Schädel auf, um zu verhindern, dass Zahnzement unter den Schädel eindringt. Sobald die Schnellversiegelung ausgehärtet ist, tragen Sie super bond gleichmäßig auf die Oberfläche des Schädels, die Oberfläche der Schnellversiegelung und die Oberfläche des Implantats auf. Sobald die Superbindung ausgehärtet ist, tragen Sie Prothesenbasisharz über super bond sowie die Haut um den Schnitt zu Beginn der Operation auf.
Nachdem das Prothesenbasisharz ausgehärtet ist, legen Sie die Kopfplatte auf das Harz um das Implantat herum und konzentrieren Sie es mit der bildgebenden Kanüle. Tragen Sie mehr Prothesenharz um und über der Kopfplatte auf, um ihre Position zu fixieren. Lassen Sie es für einige Minuten aushärten.
Vermeiden Sie es, eine dicke Zementschicht um die Kanüle herum aufzubauen, um einen besseren Zugang zum Bildfenster der Objektivlinse zu gewährleisten. Verdünnen Sie das Prothesenbasisharz, um seine Viskosität zu verringern, so dass es die Hohlräume füllen kann, die mit einem Applikator schwer zu erreichen sind. Legen Sie vorsichtig ein isoliertes Gummiband über das Fenster, um das Fenster vor möglichen Verunreinigungen durch Tierbänder zu schützen.
Fügen Sie fast Green Farbstoff-Stammlösung zu Viruslösung hinzu, verdünnen Sie sie in einem PCR-Röhrchen auf den gewünschten Titer im Verhältnis von eins zu neun. Ziehen Sie 600 Nanoliter der Viruslösung ab, entfernen Sie die Dummy-Kanüle und führen Sie die interne Kanüle ein, um sie mit der Injektionsspritze in die Führungskanüle zu verbinden. Infundieren Sie das Virus mit einer Geschwindigkeit von 15 Nanolitern pro Minute, insgesamt 10 Minuten.
Halten Sie die interne Kanüle 10 Minuten lang verbunden, damit sich das Virus unter dem Fenster ausbreiten kann. Entfernen Sie vorsichtig die innere Kanüle von der Führungskanüle und rekapitulieren Sie sie mit der Dummy-Kanüle. Induzieren Sie die Maus mit 4% Isofluran für einige Minuten.
Befestigen Sie die Kopfplatte an der Kopf gabel und befestigen Sie dann die Kopf gabel am Laufband. Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung, um die am besten zu filterende Ansicht für eine funktionale Bildgebung zu finden. Wechseln Sie dann zu einer Objektivlinse mit höherem Objektiv, um die neuronalen Aktivitäten mit Einzelzellauflösung aufzuzeichnen.
Für die Kalziumbildgebung wurde grün fluoreszierend durch eine kommerziell erhältliche 470-Nanometer-LED mit einem Standard-GFP-Filtersinn angeregt. Um fluoreszierende Spuren zu erhalten, wurden die Regionen von Interesse, die der neuronalen Zellmasse entsprechen, manuell segmentiert und von der ImageJ-Software analysiert. Für die Spannungsbildgebung mit einer 40-fachen Linse wurden optische Spannungsaufzeichnungen im nahen Infrarotkanal mit 830 Hertz-Erfassungsraten durchgeführt.
Die spontane neuronale Aktivitätsaufzeichnung dauerte kontinuierlich bis zu 25.000 Frames. Hier beschreiben wir eine Methode zur Langzeitbildgebung des Hippocampus als A1-Region bei sich verhaltenden Mäusen. Die Methode basiert auf der chronischen Implantation.
Nun das maßgeschneiderte Bildgebungsfenster, das auch die gezielte Verabreichung von Viren oder Medikamenten direkt an die interessierenden Neuronen ermöglicht. Wir glauben, dass das beschriebene Protokoll die Studien erleichtern wird, die darauf abzielen, die neuronale Aktivität mit hoher räumlicher zeitlicher Auflösung im Hippocampus von sich verhaltenden Mäusen mit einfachen und erschwinglichen 1-Photonen-Bildgebungsaufstellungen zu untersuchen.
