ねえ、みんな、私の名前はワン・ヤンドンで、私はウェストレイク大学のキリル・ピアトケビッチ分子バイオエンジニアリングラボの出身です。今日は、インビボのマウスで海馬の神経活動をイメージングする手順を紹介します。溶接機の電源を入れ、必要な温度まで加熱します。
図に示すように、画像カニューレと注入カニューレの位置を、ヘルプハンドで調整します。注射器を針で使用し、イメージングと注入カニューレの間の接続スポットに少量の適切なフラックスを5秒間塗布し、液滴を取り除きます。はんだ付けスズをマウントし、フラックスで処理された接続スポットに適用します。
それは手術中に作るために不必要な大きな頭蓋を必要とするので、余分なはんだ付けスズを避けてください。はんだ付けスズが冷めるのを待ちます。通常、数秒かかります。
ダミーカニューレを両方向に挿入して、射出カニューレがブロックされないことを確認します。爪楊枝または26ゲージの注射針を使用して、撮像カニューレの底面にUV硬化光学接着剤を塗布します。ファイントゥイザーを使用して、画像カニューレに対応するサイズのカバーガラスを慎重に配置します。
標準的なハンドヘルドUVランプからのUV照明によって少なくとも1時間接着剤を治す。IACUC承認手順に従ってイオブルランでマウスを麻酔します。手術用加熱パッドの上にステレオタキシックフレームにマウスを置きます。
耳の棒で頭を固定します。頭を少し押して、頭がしっかりと固定されていることを確認します。眼軟膏を塗布して、手術中に動物の目が乾燥するのを防ぎます。
トリマーまたは脱毛クリームを使用して、目まで首の後ろから毛皮を取り除きます。子宮切開を行う前に、ベタジンとそれに続いて70%エタノールを3回投与して外科部位を殺菌する。頭蓋骨の上部の皮膚を取り除き、頭の基底の周りに水平カットから始まり、続いて眼球方向に2つのカットが続き、まぶたにほとんど達します。
その後、正中線で収束する2つの斜めのカット。2つの無菌綿棒で、接続組織を引き込むだけでなく、首の後ろの筋肉を頭蓋骨の縁に引き込みます。過度の痛みを避けるために、ペリオスの表面に2分間リドカイン溶液を滴下します。
スカルの露出した領域全体をメスで静かに削り取り、乾燥した粗い表面を作り出します。針の先端を Lambda に配置して、AP 座標が 0 であるかどうかを確認し、ヘッドの位置が垂直かどうか、および ML 座標がゼロかどうかを確認して、ヘッドが水平に配置されていることを確認します。ない場合は、AP と ML 座標の両方が 0.1 ミリメートル以内になるまで、ステレオタックス ステーションの対応するノブを調整します。
針の先端を動かして頭蓋骨切り出し術の対応する点を見つけ、細かいマーカーを使用して頭蓋骨の位置をマークします。4 つのマークされた点に基づいて円を描き、円のカニューレ側の射出カニューレ領域の輪郭を描きます。1分間に10,000ラウンドの速度で空気圧ドリルを使用して、頭蓋骨にマークされた輪郭に沿って穏やかにドリルします。
骨の非常に薄い層が残るまで頭蓋骨を掘削し、通常は中央の穏やかなタッチの下で揺れ始めます。滅菌PBSの滴を頭蓋骨摘みの中心に塗布する。非常に薄い先端の鉗子または2つの26ゲージの針が反対側からそれに近づいていると頭蓋骨から骨のフラップを持ち上げます。
PBSに続いて穏やかな願望を適用し、26ゲージの鈍い針を数回通して硬膜の表面をきれいにする。海馬の上のコーパスカロサムと同様に皮質をアブラプに穏やかな吸引を適用します。皮質はコーパスカロサムよりも黄色いことが多い。
そして、コーパスカロサムは、通常、海馬よりも広いです.また、コーパス・カロサムは、上から観察すると垂直および水平方向に行く神経線維によって識別するのは本当に簡単です。この時点での出血は、頭蓋切り出しにおける脳組織の視認性に影響を与える。
PBSを適用し、続いて穏やかな吸引を行い、血液を取り除くために皮質を吸引している間、コーパス・カロサムは図に模式的に示すように白い繊維の方向によって認識することができる。円運動で穏やかな吸引を施すことで、層によってコーパス・カロサム繊維層を除去します。PBSは、露出した脳組織の上に蓄積された血液を取り除くために常に適用されます。
インプラントを静かに頭蓋骨の骨組に挿入します。L字針でインプラントの上にしっかりと押し付け、インプラントの光学窓を海馬の露出面にできるだけ近づけます。インプラントの周りの傷跡にPBSを繰り返し塗布し、続いて吸引してインプラント挿入中に血液をできるだけ除去する。
インプラントと頭蓋骨の間にクイックシールの薄い層を適用して、歯科用セメントが頭蓋骨の下に浸透するのを防ぎます。クイックシールが硬化したら、頭蓋骨の表面、クイックシールの表面、インプラントの表面に均等にスーパーボンドを塗布します。スーパーボンドが硬化したら、スーパーボンド以上の入れ歯ベース樹脂を塗布し、手術開始時に行った切開部の周りの皮膚を塗布します。
入れ歯ベース樹脂を硬化させた後、インプラントの周りの樹脂の上にヘッドプレートを置き、イメージングカニューレで濃縮します。ヘッドプレートの周りと上に入れ歯ベース樹脂を塗布して、その位置を固定します。数分間治しましょう。
撮像窓へのアクセスが対物レンズであることを確実にするために、カニューレの周りに厚いセメント層を構築しないでください。入れ歯ベース樹脂を希釈して粘度を下げ、アプリケータで手が届きにくい空洞を満たします。断熱したゴムテープを窓の上にそっと置き、窓を動物のバンディングによる汚染から守ります。
高速グリーン染料ストック溶液を追加して、PCRチューブで1~9の比で所望の塊に希釈します。600ナノリットルのウイルス溶液を取り出し、ダミーカニューレを取り除き、内部カニューレを注射注射器に挿入してガイドカニューレに挿入します。1分あたり15ナノリットルの速度でウイルスを注入し、合計で10分間。
ウイルスが窓の下に広がるように、内部カニューレを10分間接続し続けます。ガイドカニューレから内側のカニューレをそっと取り出し、ダミーカニューレで再現します。マウスを4%イオブルランで数分間誘導する。
ヘッドプレートをヘッドフォークに固定し、ヘッドフォークをトレッドミルに固定します。低倍率対物レンズを使用して、機能的イメージング用のフィルタビューに最適なビューを見つけます。次に、より高い対物レンズに切り替えて、単一細胞の解像度でニューロンの活動を記録します。
カルシウムイメージングの場合、グリーン蛍光は、標準GFPフィルターセンスを使用して市販の470ナノメートルLEDによって励起された。蛍光痕を得るために、対象となる領域は、ニューロン細胞質量に対応し、手動でセグメント化し、ImageJソフトウェアによって分析した。40 Xレンズを用いた電圧撮像については、830ヘルツ取得速度で近赤外チャンネルで光学電圧記録を行った。
自発的な神経活動の記録は25,000フレームまで続いた。ここでは、マウスの振る舞いにおけるA1領域としての海馬の長期イメージング方法について説明する。この方法は、慢性移植に基づいています。
今、カスタムメイドのイメージングウィンドウは、また、対象ニューロンに直接ウイルスや薬物の標的管理を可能にします。我々は、記載されたプロトコルが、シンプルで手頃な価格の1光子イメージングセットアップを使用して、マウスを振る舞う海馬における高い空間的時間分解能を有する神経活動の調査を容易にする研究を促進すると考えている。
