Эй, ребята, меня зовут Ван Яндун, и я из молекулярной биоинженергии доктора Кирилла Пяткевича в Университете Уэстлейк. Сегодня я покажу вам процедуру визуализации нейронной активности гиппокампа у мышей in vivo. Включите сварочный аппарат и нагрейте его до необходимой температуры.
Отрегулируйте положение канюли для визуализации и инъекционной канюли с помощью рук помощи, как показано на рисунке. Используя шприц с иглой, нанесите небольшое количество соответствующего типа флюса на пятна соединения между визуализацией и инъекционной канюли в течение пяти секунд, а затем удалите каплю. Установите паяльник и нанесите его на место соединения, обработанное флюсом.
Избегайте избытка паяльной олова, так как это потребует ненужного большего черепа для изготовления во время операции. Подождите, пока паяльник остынет. Обычно это занимает несколько секунд.
Убедитесь, что инъекционная канюля не заблокирована, вставив фиктивную канюлю с обеих сторон. Нанесите оптический клей для УФ-отверждения на нижнюю сторону канюли для визуализации с помощью зубочистки или иглы шприца 26-го калибра. Используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно поместить покровный стакан соответствующего размера для визуализации канюли.
Отверждайте клей в течение не менее часа ультрафиолетовым освещением от стандартной портативной УФ-лампы. Обезболить мышь изофлураном в соответствии с процедурой, одобренной IACUC. Поместите мышь в стереотаксическую рамку над хирургической грелкой.
Закрепите голову ушными вкладышами. Слегка подтолкните голову во всех направлениях, чтобы убедиться, что голова надежно закреплена. Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить пересыхание глаз животного во время операции.
Используйте триммер или крем для депиляции, чтобы удалить мех с задней части шеи до глаз. Стерилизуйте хирургический участок бетадином с последующим 70% этанолом три раза, прежде чем сделать разрез. Снимите кожу над верхней частью черепа, начиная с горизонтального разреза по всему основанию головы, за которым следуют два разреза в ростральном направлении, почти доходящих до век.
Затем два косых разреза, которые сходятся на средней линии. Двумя стерильными вактными тампонами втягивают соединительную ткань, а также мускулатуру задней части шеи к краям черепа. Нанесите каплю раствора лидокаина на поверхность надкости в течение двух минут, чтобы избежать чрезмерной боли.
Аккуратно соскоблите скальпелем весь открытый участок черепа, чтобы создать сухую и шероховатую поверхность. Поместите кончик иглы на лямбду, чтобы увидеть, равна ли координата AP нулю, чтобы подтвердить, что положение головы вертикально, а также если координата ML равна нулю, чтобы подтвердить, что голова расположена горизонтально. Если нет, отрегулируйте соответствующие ручки на стереотаксической станции до тех пор, пока координаты AP и ML не будут в пределах 0,1 миллиметра.
Переместите кончик иглы, чтобы найти соответствующие точки для краниотомии и отметить их положения на черепе, используя тонкий маркер. Нарисуйте круг на основе четырех отмеченных точек, а также контур области инъекционной канюли на стороне канюли круга. Используйте пневматическое сверло со скоростью 10 000 выстрелов в минуту, чтобы аккуратно просверлить вдоль контура, отмеченного на черепе.
Просверлите череп до тех пор, пока не останется очень тонкий слой кости, который обычно начинает покачиваться при нежном прикосновении в центре. Нанесите каплю стерильного PBS на центр краниотомии. Поднимите костный лоскут с черепа очень тонкими наконечниками щипцов или двумя иглами 26-го калибра, приближающимися к нему с противоположных сторон.
Нанесите PBS с последующими мягкими аспирациями, через тупую иглу 26 калибра несколько раз, чтобы очистить поверхность твердой мозговой оболочки. Применяйте мягкое всасывание для абляции коры головного мозга, а также мозолистого тела над гиппокампом. Кора часто желтее, чем мозолистое тело.
А мозолистое тело обычно шире гиппокампа. Кроме того, мозолистое тело действительно легко отличить по нейронным волокнам, идущим в вертикальном и горизонтальном направлениях при наблюдении сверху. Кровотечение в этот момент повлияет на видимость мозговой ткани в краниотомии.
Применяйте PBS с последующим мягким всасыванием, пока вы аспирируете кору, чтобы избавиться от крови, мозолистое тело можно распознать по направлению белых волокон, как схематично показано на диаграмме. Удалите волокна каллосума слоя за слоем, применяя мягкое всасывание круговыми движениями. PBS постоянно применяется для избавления от крови, скапливающейся над открытой мозговой тканью.
Аккуратно вставьте имплантат в краниотомию. Плотно надавить на верхнюю часть имплантата L-образной иглой, чтобы расположить оптическое окно имплантата как можно ближе к открытой поверхности гиппокампа. Многократно наносите PBS на рубец вокруг имплантата с последующим отсасыванием, чтобы удалить кровь как можно больше во время установки имплантата.
Нанесите тонкий слой быстрой пломбы между имплантатом и черепом, чтобы предотвратить проникновение зубного цемента под череп. После того, как быстрое уплотнение отверждается, равномерно нанесите суперсвязь на поверхность черепа, поверхность быстрого уплотнения и поверхность имплантата. После того, как суперсвязь вылечена, нанесите смолу основания протеза над суперсвязи, а также кожу вокруг разреза, сделанного в начале операции.
После того, как смола основания протеза отверждена, поместите головную пластину на смолу вокруг имплантата и сделайте ее концентрироваться с помощью канюли для визуализации. Нанесите больше смолы основания протеза вокруг и над головной пластиной, чтобы зафиксировать ее положение. Дайте ему затвердеть в течение нескольких минут.
Избегайте наращивания толстого слоя цемента вокруг канюли, чтобы обеспечить лучший доступ к окну изображения - объективу. Разбавьте смолу основания протеза, чтобы уменьшить его вязкость, что позволит ему заполнить полости, которые труднодоступны с помощью аппликатора. Аккуратно поместите изолированную резиновую ленту над окном, чтобы защитить окно от возможного загрязнения от ополачивания животных.
Добавьте раствор красителя Fast Green к раствору вируса, разбавляйте его до нужного титра в соотношении один к девяти, в пробирке ПЦР. Извлеките 600 нанолитров раствора вируса, извлеките муляж канюлю и вставьте внутреннюю канюлю, подключите ее к шприцу для инъекций в направляющую канюлю. Наполняют вирус со скоростью 15 нано литров в минуту, в общей сложности 10 минут.
Держите внутреннюю канюлю подключенной в течение 10 минут, чтобы вирус распространился под окном. Аккуратно снимите внутреннюю канюлю с направляющей канюли и повторите ее с помощью муляжной канюли. Индуцировать мышь 4% изофлураном в течение нескольких минут.
Прикрепите его головную пластину к головной вилке, а затем закрепите головную вилку на беговой дорожке. Используйте объектив с низким увеличением, чтобы найти наилучший для фильтрации вид для функциональной визуализации. Затем переключитесь на объектив с более высоким объективом, чтобы записать активность нейронов с разрешением одной клетки.
Для визуализации кальция зеленый флуоресцентный был возбужден коммерчески доступным 470-нанометровым светодиодом с использованием стандартного датчика фильтра GFP. Для получения флуоресцентных следов области интереса, соответствующие массе нейрональных клеток, сегментировали вручную и анализировали программное обеспечение ImageJ. Для визуализации напряжения с использованием объектива 40 X оптические записи напряжения выполнялись в ближнем инфракрасном канале со скоростью захвата 830 Гц.
Запись спонтанной нейронной активности длилась непрерывно до 25 000 кадров. Здесь мы описываем метод долгосрочной визуализации гиппокампа как области А1 у мышей. Метод основан на хронической имплантации.
Теперь есть специальное окно визуализации, которое также позволяет целенаправленно ввести вирусы или лекарства непосредственно в интересующие нейроны. Мы считаем, что описанный протокол облегчит исследования, направленные на изучение активности нейронов с высоким пространственным временным разрешением в гиппокампе мышей с использованием простых и доступных 1-фотонных наборов визуализации.
