היי, חבר'ה, קוראים לי וואנג יאנג-דונג, ואני ממעבדת הביו-הנדסה המולקולרית של ד"ר קיריל פיאטקוביץ' באוניברסיטת ווסטלייק. היום, אני אראה לך את ההליך להדמיית פעילויות עצביות של היפוקמפוס בעכברים, ב-vivo. הפעל את מכונת הריתוך וחמם אותה לטמפרטורה הנדרשת.
להתאים את המיקום של הצינורית הדמיה ואת הצינורית ההזרקה באמצעות ידיים עוזרות כפי שמוצג באיור. באמצעות המזרק עם המחט, להחיל כמות קטנה של סוג מתאים של שטף על כתמי החיבור בין הדמיה והזרקת קנולה במשך חמש שניות, ולאחר מכן להסיר את הטיפה. הר פח הלחמה ולהחיל אותו על נקודת החיבור שטופלו בשטף.
הימנע פח הלחמה עודף כפי שהוא ידרוש גולגולת גדולה מיותרת לעשות במהלך הניתוח. חכה לפח הלחמה להתקרר. בדרך כלל, זה לוקח כמה שניות.
ודא כי הצינורית ההזרקה אינה חסומה על ידי החדרת הצינורית דמה משני הכיוונים. החל דבק אופטי ריפוי UV בצד התחתון של הצינורית הדמיה באמצעות קיסם או מחט מזרק 26-מד. השתמש פינצטה בסדר בזהירות למקם כיסוי בגודל המתאים קנולה הדמיה.
לרפא את הדבק לפחות שעה על ידי תאורת UV ממנורה UV כף יד סטנדרטית. יש למרדים את העכבר באמצעות isoflurane בהתאם לנוהל שאושר על-ידי IACUC. הנח את העכבר במסגרת סטראוטקסית מעל כרית חימום לניתוח.
אבטחו את הראש עם מוטות אוזניים. מעט לדחוף את הראש לכל הכיוונים כדי לוודא את הראש מאובטח בחוזקה. יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע מעיני החיה להתייבש במהלך הניתוח.
השתמש גוזם או קרם depilatory כדי להסיר את הפרווה מהחלק האחורי של הצוואר עד העיניים. לעקר את האתר הכירורגי עם betadine ואחריו 70% אתנול שלוש פעמים לפני ביצוע חתך. הסר את העור מעל החלק העליון של הגולגולת, החל עם חתך אופקי סביב בסיס הראש, ואחריו שני חתכים בכיוון rostral, כמעט להגיע העפעפיים.
ואז שני חתכים אלכסוניים שמתכנסים בקו האמצע. עם שתי ספוגיות כותנה סטריליות, לסגת הרקמה המחברת, כמו גם את השרירים של החלק האחורי של הצוואר אל קצות הגולגולת. החל טיפה של פתרון לידוקאין על פני השטח של periosteum במשך שתי דקות, כדי למנוע כאב מוגזם.
בעדינות לגרד את כל האזור החשוף של הגולגולת עם אזמל כדי ליצור משטח יבש ומחוספס. הנח קצה המחט על למבדה כדי לראות אם קואורדינטת AP היא אפס כדי לאשר כי מיקום הראש הוא אנכי, כמו גם אם קואורדינטת ML הוא אפס, כדי לאשר את הראש ממוקם אופקית. אם לא, כוונן את ידיות הכתב בתחנה הסטראוטקסית עד שנקודות הציון AP ו- ML יתאימו ל- 0.1 מילימטרים.
להזיז את קצה המחט כדי למצוא את הנקודות המתאימות עבור craniotomy ולסמן את מיקומם על הגולגולת, באמצעות סמן עדין. צייר עיגול המבוסס על ארבע נקודות מסומנות, כמו גם את קווי המתאר של אזור הצינורית ההזרקה בצד הצינורית של העיגול. השתמש במקדחה פנאומטית במהירות של 10,000 סיבובים לדקה כדי לקדוח בעדינות לאורך קווי המתאר המסומנים בגולגולת.
לקדוח את הגולגולת עד שכבה דקה מאוד של העצם נשאר, אשר בדרך כלל מתחיל להתנועע תחת מגע עדין במרכז. החל טיפה של PBS סטרילי למרכז הגולגולת. הרם את דש העצם מהגולגולת עם מלקחיים דקים מאוד או שני מחטים 26-מד מתקרבים אליו מהצדדים הנגדיים.
החל PBS ואחריו שאיפות עדינות, באמצעות מחט קהה 26 מד מספר פעמים כדי לנקות את פני השטח של הדורה. החל יניקה עדינה כדי להבליט את קליפת המוח, כמו גם את כפיס המוח קורפוס מעל ההיפוקמפוס. קורטקס הוא לעתים קרובות צהוב יותר מאשר כפיס המוח קורפוס.
וקאלוסום קורפוס הוא בדרך כלל רחב יותר מאשר ההיפוקמפוס. חוץ מזה, כפיס המוח הוא באמת קל להבחין על ידי סיבים עצביים הולך בכיוונים אנכיים ואופקיים כאשר נצפה מלמעלה. דימום בשלב זה ישפיע על הראות של רקמת המוח בגולגולת.
החל PBS, ואחריו יניקה עדינה, בזמן שאתה מזיע את קליפת המוח כדי להיפטר מהדם, קורפוס קלוסום ניתן לזהות על ידי הכיוון של הסיבים הלבנים כפי שמוצג באופן סכמטי בתרשים. הסר סיבי כפיס המוח שכבה אחר שכבה על ידי החלת יניקה עדינה בתנועה מעגלית. PBS מוחל כל הזמן כדי להיפטר דם מצטבר מעל רקמת המוח חשופה.
הכנס בעדינות את השתל לתוך הגולגולת. לחץ בחוזקה על גבי השתל עם המחט בצורת L כדי למקם את החלון האופטי של השתל קרוב ככל האפשר לפני השטח החשופים של ההיפוקמפוס. שוב ושוב להחיל PBS על הצלקת סביב השתל, ואחריו יניקה כדי להסיר דם ככל האפשר במהלך החדרת השתל.
יש למרוח שכבה דקה של חותם מהיר בין השתל לגולגולת כדי למנוע חדירה של מלט דנטלי מתחת לגולגולת. לאחר החותם המהיר נרפא, להחיל קשר סופר באופן שווה על פני השטח של הגולגולת, את פני השטח של החותם המהיר ואת פני השטח של השתל. לאחר הקשר סופר נרפא, להחיל שף בסיס תותבת מעל קשר סופר, כמו גם את העור סביב החתך שנעשה בתחילת הניתוח.
לאחר שצורף בסיס התותבת נרפא, מניחים את צלחת הראש על השרף סביב השתל ולהפוך אותו להתרכז עם הצינורית הדמיה. החל יותר משרף בסיס תותבת סביב ומעל צלחת הראש כדי לתקן את מיקומו. תן לזה תרופה לכמה דקות.
הימנע מבניית שכבה עבה של מלט סביב הצינורית כדי להבטיח גישה טובה יותר לחלון ההדמיה היא העדשה האובייקטיבית. לדלל את שרף בסיס התותבת כדי להקטין את צמיגותו, ובכך לאפשר לו למלא את החללים אשר קשה להגיע עם אפליקטור. מניחים בעדינות סרט גומי מבודד מעל החלון כדי להגן על החלון מפני זיהום אפשרי מפני פסים של בעלי חיים.
הוסף פתרון מלאי צבע ירוק מהיר לפתרון וירוס לדלל אותו טיטר הרצוי ביחס של אחד עד תשע, בצינור PCR. למשוך 600 ננו ליטר של פתרון הנגיף, להסיר את הצינורית דמה ולהכניס את הצינורית הפנימית לחבר אותו מזרק הזרקה לתוך הצינורית מדריך. להחדיר את הנגיף במהירות של 15 ננו ליטר לדקה, במשך 10 דקות בסך הכל.
שמור את הצינורית הפנימית מחובר במשך 10 דקות כדי לאפשר את הנגיף להתפשט מתחת לחלון. הסר בעדינות את הצינורית הפנימית מהקנולה המנחה וסכם אותה מחדש עם הצינורית הבובה. לגרום לעכבר עם 4% isoflurane במשך כמה דקות.
תקן את צלחת הראש שלו למזלג הראש, ולאחר מכן לתקן את מזלג הראש להליכון. השתמש בעדשת יעד הגדלה נמוכה כדי למצוא את התצוגה הטובה ביותר לסינון עבור דימות פונקציונלי. לאחר מכן, עבור לעדשה אובייקטיבית גבוהה יותר כדי לתעד את הפעילויות העצביות ברזולוציית תא בודד.
להדמיית סידן, פלואורסצנט ירוק התרגש על ידי LED מסחרי זמין 470 ננומטר באמצעות חוש מסנן GFP סטנדרטי. כדי להשיג עקבות פלואורסצנטיים, אזורי האינטרסים, המתאימים למסת תא עצבי חולקו באופן ידני וניתחו על ידי תוכנת ImageJ. להדמיית מתח באמצעות הקלטות מתח אופטי של עדשת X 40 בוצעו בערוץ האינפרא-אדום הקרוב בשיעורי רכישה של 830 הרץ.
הקלטת פעילות עצבית ספונטנית נמשכה ברציפות עד 25,000 מסגרות. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה ארוכת טווח של ההיפוקמפוס כאזור A1 בעכברים מתנהגים. השיטה מבוססת על ההשתלה הכרונית.
עכשיו חלון ההדמיה בהתאמה אישית, המאפשר גם ניהול ממוקד של וירוסים או תרופות ישירות לנוירונים בעלי עניין. אנו מאמינים כי הפרוטוקול המתואר יקל על המחקרים שמטרתם לחקור פעילות עצבית עם רזולוציה זמנית מרחבית גבוהה בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים באמצעות סטים פשוטים ובמחיר סביר של הדמיית פוטון 1.
