Oye, chicos, mi nombre es Wang Yangdong, y soy del laboratorio de bioingeniería molecular Dr.Kiryl Piatkevich en la Universidad de Westlake. Hoy, voy a mostrarles el procedimiento para obtener imágenes de las actividades neuronales del hipocampo en ratones, in vivo. Encienda la máquina de soldadura y címela hasta la temperatura requerida.
Ajuste la posición de la cánula de la proyección de imagen y de la cánula de la inyección usando las manos que ayudan como se muestra en la figura. Usando la jeringa con la aguja, aplique una pequeña cantidad de tipo apropiado de fundente sobre los puntos de conexión entre la imagen y la cánula de inyección durante cinco segundos, y luego retire la gotita. Monte lata de soldadura y aplíquela al punto de conexión tratado con el fundente.
Evite el exceso de soldadura de lata, ya que requerirá un cráneo más grande innecesario para hacer durante la cirugía. Espere a que la lata de soldadura se enfríe. Por lo general, tarda varios segundos.
Confirme que la cánula de inyección no está bloqueada insertando la cánula ficticia desde ambas direcciones. Aplique adhesivo óptico de curado UV en la parte inferior de la cánula de imágenes con un palillo de dientes o una aguja de jeringa de calibre 26. Use una pinza fina para colocar cuidadosamente un vaso de cubierta del tamaño correspondiente a la cánula de imágenes.
Cure el adhesivo durante al menos una hora mediante iluminación UV de una lámpara UV de mano estándar. Anestesiar el ratón con isoflurano según el procedimiento aprobado por el IACUC. Coloque el ratón en un marco estereotáxico sobre una almohadilla de calentamiento de cirugía.
Asegure la cabeza con barras para los oídos. Empuje ligeramente la cabeza en todas las direcciones para asegurarse de que la cabeza esté firmemente asegurada. Aplique ungüento para los ojos para evitar que los ojos del animal se sequen durante la cirugía.
Use una recortadora o crema depilatoria para eliminar el pelaje desde la parte posterior del cuello hasta los ojos. Esterilice el sitio quirúrgico con betadina seguida de etanol al 70% tres veces antes de hacer una incisión. Retire la piel sobre la parte superior del cráneo, comenzando con el corte horizontal alrededor de la base de la cabeza, seguido de dos cortes en la dirección rostral, casi llegando a los párpados.
A continuación, dos cortes oblicuos que convergen en la línea media. Con dos hisopos de algodón estériles, retraer el tejido de conexión, así como la musculatura de la parte posterior del cuello a los bordes del cráneo. Aplique una gota de solución de lidocaína en la superficie del periostio durante dos minutos para evitar un dolor excesivo.
Raspe suavemente toda el área expuesta del cráneo con un bisturí para crear una superficie seca y áspera. Coloque la punta de la aguja en el Lambda para ver si la coordenada AP es cero para confirmar que la posición de la cabeza es vertical, así como si la coordenada ML es cero, para confirmar que la cabeza está posicionada horizontalmente. Si no es así, ajuste las perillas correspondientes en la estación estereotáxica hasta que las coordenadas AP y ML estén dentro de 0,1 milímetros.
Mueva la punta de la aguja para encontrar los puntos correspondientes para la craneotomía y marque sus posiciones en el cráneo, utilizando un marcador fino. Dibuje un círculo basado en cuatro puntos marcados, así como el contorno del área de la cánula de inyección en el lado de la cánula del círculo. Utilice un taladro neumático a la velocidad de 10,000 rondas por minuto para perforar suavemente a lo largo del contorno marcado en el cráneo.
Perfore el cráneo hasta que quede una capa muy delgada de hueso, que generalmente comienza a moverse bajo un toque suave en el centro. Aplique una gota de PBS estéril en el centro de la craneotomía. Levante el colgajo óseo del cráneo con las órceps de punta muy delgada o dos agujas de calibre 26 que se acercan desde los lados opuestos.
Aplique PBS seguido de aspiraciones suaves, a través de una aguja roma de calibre 26 varias veces para limpiar la superficie de la duramadre. Aplique una succión suave para ablacionar la corteza, así como el Cuerpo Calloso por encima del hipocampo. La corteza es a menudo más amarilla que el Cuerpo Calloso.
Y el Cuerpo Calloso suele ser más ancho que el hipocampo. Además, el Cuerpo Calloso es realmente fácil de distinguir por las fibras neuronales que van en las direcciones vertical y horizontal cuando se observa desde la parte superior. El sangrado en este punto afectará la visibilidad del tejido cerebral en la craneotomía.
Aplique PBS, seguido de una succión suave, mientras aspira la corteza para deshacerse de la sangre, Corpus Callosum se puede reconocer por la dirección de las fibras blancas como se muestra esquemáticamente en el diagrama. Retire las fibras de Cuerpo Calloso capa por capa aplicando una succión suave en un movimiento circular. Pbs se aplica constantemente para deshacerse de la acumulación de sangre por encima del tejido cerebral expuesto.
Inserte suavemente el implante en la craneotomía. Presione firmemente la parte superior del implante con la aguja en forma de L para colocar la ventana óptica del implante lo más cerca posible de la superficie expuesta del hipocampo. Aplique repetidamente PBS en la cicatriz alrededor del implante, seguido de succión para extraer la sangre tanto como sea posible durante la inserción del implante.
Aplique una capa delgada de sello rápido entre el implante y el cráneo para evitar que el cemento dental penetre debajo del cráneo. Una vez que el sello rápido se cura, aplique super enlace uniformemente en la superficie del cráneo, la superficie del sello rápido y la superficie del implante. Una vez que el súper enlace se cura, aplique la resina de base de la dentadura por encima del súper enlace, así como la piel alrededor de la incisión realizada al comienzo de la cirugía.
Después de que la resina de la base de la dentadura se cure, coloque la placa de la cabeza en la resina alrededor del implante y haga que se concentre con la cánula de la proyección de imagen. Aplique más resina de base de dentadura alrededor y por encima de la placa de la cabeza para fijar su posición. Deja que se cure durante varios minutos.
Evite construir una gruesa capa de cemento alrededor de la cánula para garantizar un mejor acceso a la ventana de imágenes es la lente objetivo. Diluya la resina de base de la dentadura para disminuir su viscosidad, lo que le permite llenar las cavidades que son difíciles de alcanzar con un aplicador. Coloque suavemente una cinta de goma aislada sobre la ventana para protegerla de una posible contaminación de las bandas de animales.
Agregue la solución de culata de colorante Fast Green a la solución de virus diluirla al título deseado en la proporción de uno a nueve, en un tubo de PCR. Retire 600 nano litros de la solución del virus, retire la cánula ficticia e inserte la cánula interna conéctelo a la jeringa de inyección en la cánula guía. Infundir el virus a la velocidad de 15 nano litros por minuto, durante 10 minutos en total.
Mantenga la cánula interna conectada durante 10 minutos para permitir que el virus se propague debajo de la ventana. Retire suavemente la cánula interna de la cánula guía y recapitulala con la cánula ficticia. Induzca el ratón con isoflurano al 4% durante unos minutos.
Fije su placa de la cabeza a la horquilla de la cabeza, y luego fije la horquilla de la cabeza a la cinta de correr. Utilice una lente de objetivo de bajo aumento para encontrar la mejor vista de filtro para obtener imágenes funcionales. Luego, cambie a una lente objetivo más alta para registrar las actividades neuronales a resolución unicelular.
Para las imágenes de calcio, el fluorescente verde fue excitado por un LED de 470 nanómetros disponible en el mercado utilizando un sentido de filtro GFP estándar. Para obtener trazas fluorescentes, las regiones de interés, correspondientes a la masa celular neuronal se segmentaron manualmente y se analizaron mediante el software ImageJ. Para la proyección de imagen del voltaje usando una lente 40 X las grabaciones ópticas del voltaje fueron realizadas en el canal infrarrojo cercano en las tarifas de adquisición de 830 Hertz.
La grabación neuronal espontánea de la actividad duró continuamente hasta 25.000 fotogramas. Aquí, se describe un método para la proyección de imagen a largo plazo del hipocampo como una región A1 en ratones que se comportan. El método se basa en la implantación crónica.
Ahora la ventana de imágenes a medida, que también permite la administración dirigida de virus o fármacos directamente a las neuronas de interés. Creemos que el protocolo descrito facilitará los estudios que tienen como objetivo investigar la actividad neuronal con alta resolución temporal espacial en el hipocampo de ratones que se comportan utilizando simples y asequibles 1-fotón configuración de imágenes.
