此协议的目标是简化 CRISPR/Cas9 在荧光记者的帮助下，在巨噬细胞和 T 细胞线中进行介质的敲击实验，并影响细胞分拣。ROSA26 蝗虫被称为插入转基因的基因组安全港。在26个细胞的老鼠世界里，或在人类正宗日志中，表达感兴趣的蛋白质，无论是否遭到攻击，都是一种常见的表达。
第1部分:针对罗莎26蝗虫的sgRNA的设计与普拉斯米德建筑。首先，使用小鼠基因组信息学序列和组合基因组浏览器，从小鼠Rosa26位位设计sgRNA，然后下载小鼠Rosa26基因的基因组序列。去在线网络工具， CRISPOR， 粘贴 100 基础对的输入序列从 Rosa26 蝗虫.
然后选择一个基因组，例如，肌肉-小鼠参考基因组2011年。接下来，选择 PAM 的类型。使用 20bp NGG"PAM 主题，由 spCas9 识别。
单击"提交"。选择具有高特异性分数、高做分和较少偏离目标的指南。应避免指示效率低下的指南。
值得注意的是，最好选择两个序列重叠的指南，这可能会提高报告的敲击效率。对于温餐序列，合成一个转发非法和逆转非法，其中退火磷和准备克隆的因素。准备线性减少每个Vactor可以表达的是，我不得不记者由BBS一消化，如得到尼尔，法律线性载体产生最终构造，这同时表示引导RNA和CAS九核与DSRIP两个荧光记者连接。
第二部分:将目标矢量构建为同源重组模板。表达感兴趣的蛋白质。例如，人类持续了。
您希望通过商业来源和亲和力 OST 标签或其他常用的攻击来合成 cDNA 序列，以便蛋白质的纯化可以融合到 cDNA 序列中。请记住，在 cDNA 启动之前，请包含哈萨克共识序列。通过Asc1限制酶消化，喜欢得到CD和插入到骨干。
血管，即pKhR26-IBFP IBP产生最终目标浓缩容器，每个，KB的五个黄金和三个黄金同源武器。表达演员集包括一个CG推广人，UST餐厅，如果你想库宁地区链接到虹膜，如果VFD记者和多AC基金。最后，使用独特的切割剂酶（如 EcoR1 或 BamH1）瞄准载体，在零下 20 度的电极笔记中对消化和产品进行净化。
建议获得高浓度的线性病媒DNA。第三部分:在杰里茎细胞分离后，巨噬细胞和T细胞系的电位化准备细胞培养。转染时，最佳细胞密度约为每毫升50万细胞。
全电在10个宏观小核时尚尖端格式准备一个24井板包含500微升的完全生长，介质没有抗生素在每口井。预热板在加湿37度，5%覆盖设置孵化器。关闭电动操作系统输入喷射猫或罗萨莱斯的电聚参数。
准备细胞DNA混合物随访或手术收集鸡细胞。柯钦25平方厘米的烧瓶转移细胞在15种动物。既然你管，然后菲利普细胞通过离心在90倍G在室温下8分钟，要求它，超分子。
对于洗涤，使用五个 ML PBS 重新使用电池，然后使用与前一步相同的条件通过离心旋转细胞悬浮。删除 DPP。并使用两个 ML 的 DBS 重新使用细胞枕头。
您保持微小细胞悬架，并与等量的0.2%特雷潘巴鲁混合，以计算插槽插入康妮幻灯片在自动细胞康纳和查看图像本身估计细胞计数负载样本。然后获取细胞计数结果。计算200万个细胞将发现每个敲击实验的电电声名声，通过离心化将细胞数量转移到1.5ML.离心两个颗粒细胞中。
为了节省时间，在离心过程中可以制备电化混合物，每增加2.5微克CRISPR CAS 9载体2.4微克贝琳达大米，健谈载体，并重新悬浮布法罗。我们的总容量为 55 宏观垃圾在一个新的 1.5 ML 离心管轻轻地顶点和。简要地，可以很好地混合。
使用前留下卢克索压力混合物和室温。旋转阿斯一周后，DTB 本质上是将导火索再熔断 30 秒，通过轻轻地向上和向下添加准备好的电聚混合物移液器，尽可能多地去除超高分子，重新悬浮细胞。电位要求使用10微小核派系尖端的细胞电聚变频器是移液器的重要。
在皮宠物期间避免气泡会使电镀失败付出代价。按开始。之后，操作在一段时间内转移样品。
在24个井板中，总介质的预警告在其余4个复制样品上执行与上述相同的电压和程序，轻轻摇动板，以确保细胞均匀分布。在37度孵化器中孵育细胞48至72小时。在此之前，细胞分拣在转染后24小时，检查干扰两个餐厅记者的表情使用荧光显微镜分离代表为我们自己表明，电电工作正常。
第4部分:细胞分类以隔离假定敲击细胞。在细胞分拣准备之前，在96个井板与150微小的细胞类型特定毛中等每井使用错误的底部微地方培养和本身和平面底部微的地方，所有细胞转移到无菌FACS保持管在冰上，并把盒子在路径通过窗口， 当适用设置细胞分拣机时，连接到细胞分拣室，配备 85 微米喷嘴和低流量的免疫细胞分拣，以实现最佳的细胞可评估性和生存性，并短暂地从直通窗口顶点采集样本，并在采集中加载样品。Champer 为细胞排序设置了事实滑冰，首先定义了福特散射和侧散射的销售漏斗，然后通过获得设置谈话红色负细胞来定义生命细胞。
接下来，他们使用FSC H和FSE多变块，通过单单点盖住找到活的单细胞。最后为所需的DSR二和B设置了一扇闸门，如果沃尔沃正子人口，这表明细胞成功地与CRISPR载体和口袋载体共同感染。因此，10个单细胞在每口井的96个，井板辅以预热，完整的生长介质使用周期模式或单细胞模式后分拣孵化96，井板在细胞培养孵化器中进行细胞扩张。
第五部分:筛选正撞击细胞的高程 经过大约两周的细胞扩张后存活下来，48井板中的细胞使用壁型细胞作为负控制细胞群，利用少量增殖自身来评估BFP或流细胞的表达，保持较高的BFP阳性细胞百分比，以完成从我们应该表达的细胞中提取基因组DNA的验证BFP通过PCR通过分离的基因组DNA与底漆跨越同源臂的每一侧，即一个主要位置在基因组序列，外部的目标载体。在本次实验中，与向量对话的一面是，预测的PCR产品尺寸与原体放大为1.2千伏。与 F 二和 R 二是 1.2 KB 桑格测序结果。因此，PCR 产品显示每个集成路口的序列，显示罗莎 26 Lucas 的正确和敲击位置。
我说像免疫印迹一样， 能够验证正确的敲击蛋白质水平第六部分的代表性结果。例如，在之前的研究中，我们表示，得到45个分子钉，与OSD标签之间的相互，并有一个26个点在结账T细胞随后美元机智。我得到 45 和事件导演或拉下来的亲和力净化和质谱的主体。
他们蛋白细胞学数据揭示了T细胞的相互作用。因此，这个产品库极大地促进了寻找新的相互作用器来阐明给定蛋白质的功能。此技术演示表明，通过瞬态表达增加每个投线 RFP 与谈话载体共同表达和 BFP 为 Rosa 26 点。
我们在T细胞和巨噬细胞中都产生了具有永久基因表达的敲击细胞系，这在基因操作中是很难实现的。这种方法和建议适用于克里斯允许在大DNA片段的断言免疫细胞的机械研究，如蛋白质的识别，蛋白质相互作用研究。
