O objetivo deste protocolo é simplificar o experimento de knock-in mediado do CRISPR/Cas9 em linhas de macrófago e células T, com o auxílio de repórteres fluorescentes e afetar a classificação celular. ROSA26 Locus é conhecido como um local de porto seguro genômico para inserção de transgenes. É comum expressar proteína de interesse com ou sem ataque no mundo do rato de 26 lócus, ou no tronco ortográfico humano.
Parte 1:Projeto e a Construção Plasmid de sgRNAs visando Rosa26 Locus. Primeiro, projete sgRNAs do mouse Rosa26 locus, usando sequências de informática do genoma do mouse, e Ensemble Genome Browser, em seguida, baixe a sequência genômica do gene do mouse Rosa26. Vá para a ferramenta web online, CRISPOR, cole 100 pares base da sequência de entrada do Lócus Rosa26.
Em seguida, selecione um genoma, por exemplo, mus musculus-mouse referência genoma 2011. Em seguida, selecione o tipo de PAM. Use o motivo 20bp NGG"PAM, reconhecido por spCas9.
Clique em Enviar. Escolha guia com uma pontuação de alta especificidade, pontuação alta e menos fora dos alvos. As guias indicadas como ineficientes devem ser evitadas.
Notavelmente, é preferível selecionar dois guias com sequências sobrepostas, o que pode aumentar a eficiência do knock-in conforme relatado. Para uma sequência de jantar quente, sintetize um avanço ilegal e uma reversão ilegal, que resmou fosforated e pronto para a clonagem para fatorar. Prepare a diminuição linearizada por Vactor a que poderia expressar é que eu tenho que repórter por BBS uma digestão, como obter o Neal, os legais para o vetor linearizado para gerar o construto final, que simultaneamente expressa guia RNA e o núcleo CAS nove ligados a um DSRIP dois repórter fluorescente.
Parte Dois:Construção do Vetor de Alvo como Modelo de Recombinação Homologos. Para a expressão da proteína do interesse. Por exemplo, o humano durou até.
Você quer sintetizar a sequência cDNA por fonte comercial e afinidade A tag OST ou outro ataque comumente usado para purificação de proteínas pode ser fundido à sequência cDNA. Lembre-se de incluir a sequência de consenso kazak antes do início do cDNA. Digerido pela enzima de restrição Asc1, e como obter o CD e a inserção na espinha dorsal.
Vactor, ou seja, pKhR26-IBFP IBP cedendo o último foco de mira do recipiente, cada um, KB de cinco braços primos e três principais homólogos. O conjunto de expressões inclui um promotor de CG, o restaurante UST, se você quiser a região koonin ligada a uma Iris, se o repórter VFD e um fundo poli AC. Finalmente no horizonte visando vetor usando enzimas de cortador únicas, como EcoR1 ou BamH1, os digestos e o produto são purificados em uma loja que menos 20 graus em notas de eletroporação.
Recomenda-se obter alta concentração de DNA vetorial linearizado. Parte três: Eletroporação de linhas macrófagos e t-cell preparam a cultura celular seguida de separação para células Geritalk. A densidade celular ideal foi de aproximadamente 0,5 milhões de células por ML no momento da transfecção.
Eletroporação completa em dez formatos de ponta de moda nuclear macro prepara uma placa de 24 poços contendo 500 microliteres de crescimento completo, médio sem antibióticos em cada poço. Pré-aquecimento das placas em 37 graus umidificados, 5% cobrindo essa incubadora de ajuste. Abaixe os parâmetros de eletroporação de entrada do sistema de operação elétrica para jet cat ou Rosales.
Prepare os acompanhamentos da mistura de DNA celular ou a operação de coleta de células de frango. Curchin 25 centímetros quadrados de células de transferência de frasco nos 15 animais. Desde o tubo do you, então Phillip as células por centrofugação a 90 vezes G por oito minutos em temperatura ambiente, peça por ele, os supernantes.
Para lavar, resuspenco as células com o PBS de cinco ML e gire a suspensão celular por centrifugação usando a mesma condição da etapa anterior. Remova os DPPs. E resuspense os travesseiros de célula usando dois ML de DBS.
Você permanece micro pequena suspensão celular e mistura com o volume igual de 0,2% Trepan Ballou para estimar a amostra de carga de contagem de células em termos de contagem de slot inserir connie slide na célula automatizada Connor e ver a imagem em si. Então obtenha um resultado de contagem de células. Calcule 2 milhões de células encontrarão reputações de eletroporação por experimento de batida transferir o número de células para 1,5 ML.Centrifuge duas células de pelotização por centrifugação.
Para economizar tempo, a mistura de eletroporação pode ser preparada durante a centrifugação que adiciona 2,5 microgramas de cada um dos nove vetores CRISPR CAS 2.4 de arroz Belinda, vetor falante e re suspensão buffalo. Nosso volume total de 55 macro lixo em um novo tubo centrifusado de 1,5 ML suavemente vértice e. Por pouco tempo, pode misturar bem.
Deixe a mistura de pressão Luxor e temperatura ambiente antes de usar. Depois de girar aspart, o DTB é este essencialmente fusível por mais 30 segundos, remover o máximo de supernasce possível re suspendir células adicionando a mistura de eletroporação preparada pipeta para cima e para baixo suavemente. A eletroporação pedida para o misturador de eletroporação celular usando 10 micro pequenas pontas de facção nuclear foi importante.
Evite bolhas de ar durante o acariciamento pi, custará falha de eletroplacar. Comece a pressionar. após a qual a operação transfira a amostra em um tempo.
Bem, de 24, placas de poço com pré-aviso o meio bruto realizam a mesma pressão elétrica e procedimentos acima nas quatro amostras replicadas restantes, balançam suavemente a placa para garantir a distribuição uniforme das células. Incubar as células na incubadora de 37 graus por 48 a 72 horas. Antes da ocorrência, a triagem celular Às 24 horas após a transfecção, examine a expressão de disruptão dois para repórter de restaurante usando microscopia florescente separada do próprio representante para nós mesmos indica que a eletroporação está funcionando corretamente.
Parte 4:classificação celular para isolar células putativas. Antes de preparar a triagem celular, em 96 placas de poço com 150 micro pequenos do tipo celular médio bruto específico por bem use micro lugar inferior errado para cultura e si mesmo e o micro lugar fundo plano para todas as células transferir células em um FACS estéril para manter o tubo no gelo e colocar a caixa no caminho através da janela, conexão com a sala de triagem celular quando aplicável definir o classificador celular com 85 micrometros de bocal e baixa taxa de fluxo para classificação de células imunes para alcançar a melhor evalubilidade celular e sobrevivência colher amostras do vértice da janela de passagem brevemente, e carregar a amostra nas aquisições. Champer criou a patinação de fatos para a classificação celular primeiro funis de vendas definidos para a dispersão ford e dispersão lateral, em seguida, definir as células de vida, ganhando o conjunto fala células vermelhas negativas.
Em seguida, eles encontram uma célula única ao vivo por um único singlet gating usando o FSC H versus FSE um bloco multivariou. Finalmente defina um portão para os DSRs desejados dois e B se a subpopulação positiva do Volvo, que indica células co transinfetadas com sucesso com vetor CRISPR e vetor de bolso. Assim, 10 células únicas em cada poço do 96, placa bem suplementada com o pré-aquecimento, o meio de crescimento completo usando modo de período ou modo de célula única após a triagem incubar as placas de 96, poços na incubadora de cultura celular para expansão celular.
Parte cinco: triagem da elevação de células positivas após aproximadamente duas semanas de expansão celular após a sobrevivência, as células da placa de 48 poços avaliam a expressão de BFP ou citometria de fluxo usando uma pequena proporção de proliferação usando as células do tipo parede como uma célula de controle negativo populações, possuindo maior porcentagem de células positivas de BFP são mantidas para cumprir o extrato de validação do DNA genômico das células que devemos expressar BFP passar o DNA genômico isolado por PCR com primers abrangendo cada lado dos braços homólogos, ou seja, um local primário na sequência genômica, exterior ao vetor de alvo. O lado visto para falar com o vetor neste experimento, o tamanho previsto do produto PCR amplificado com o principal é de 1,2 KV. E com F 2 e R dois é 1.2 KB Sanger resultados de sequenciamento. Assim, os produtos PCR mostram as sequências de cada junção de integração demonstrando a posição correta e batendo no Rosa 26 Lucas.
Eu digo que a mancha imuno permite a validação da batida correta no nível de proteína parte seis resultados representativos. Como exemplo, publicado em estudo anterior, expressamos que obter 45 moléculas tack que o inter com uma tag OSD, e havia um 26 locus em checkout T-cells subsequentemente USD tato. Eu recebo 45 diretores de incidentes ou puxado para baixo por purificação de afinidade e um sujeito à espectrometria de massa.
Os dados de proteômica revelaram interação das células T. Portanto, esta piscina de produtos facilitou muito a busca de novos intercaladores para elucidar a função de uma determinada proteína. Esta apresentação técnica mostrou que por transitos expressas aumento por linha de elenco RFP com o vetor falante co-expresso e BFP para lócus Rosa 26.
Geramos linhas celulares batendo com expressão genética permanente em células T e macrófagos, que são difíceis de executar em manipulações genéticas. Esses métodos e recomendações são aplicáveis a Chris permitidos em afirmações de grande segmento de DNA para estudos mecanicistas de células imunes, como para identificação de proteínas, estudo de interação proteica.
