מטרת פרוטוקול זה היא לפשט את ניסוי הנוק-אין המתווך CRISPR/Cas9 בקווים של תא מקרופאגים ותאי T, בעזרת כתבים פלואורסצנטיים ולהשפיע על מיון תאים. ROSA26 לוקוס ידוע כאתר נמל בטוח גנומי להחדרת טרנסג'נים. זה הרגיל להביע חלבון של עניין עם או בלי התקפה בעולם העכבר של 26 לוקוס, או ביומן האורתופדיה האנושית.
חלק 1: עיצוב ובניית פלסמיד של sgRNAs מיקוד Rosa26 לוקוס. ראשית, עיצוב sgRNAs מן העכבר Rosa26 לוקוס, באמצעות רצפים מן אינפורמטיקה גנום העכבר, ודפדפן הגנום אנסמבל, ולאחר מכן להוריד את הרצף הגנומי של הגן Rosa26 העכבר. עבור אל כלי האינטרנט המקוון, CRISPOR, הדבק 100 זוג בסיס של רצף הקלט מ- Rosa26 Locus.
לאחר מכן בחר גנום, למשל, גנום התייחסות שרירים ועכבר 2011. לאחר מכן, בחר את סוג ה- PAM. השתמש במוטיב NGG"PAM של 20bp, המזוהה על-ידי spCas9.
לחץ על שלח. בחר מדריך עם ציון ייחודיות גבוה, ציון ביצוע גבוה ופחות מחוץ ליעדים. יש להימנע ממדריכים המצוינים כחי כשם שלא יעילים.
ראוי לציין, מומלץ לבחור שני מדריכים עם רצפים חופפים, אשר עשוי להגביר את יעילות knock-in כפי שדווח. לרצף הסעודה החמה, לסנתז קדימה לא חוקי היפוך בלתי חוקי, אשר חישל זרחן ומוכן לשיבוט לגורם. הכן את הירידה הליניארית לכל Vactor אשר יכול להביע הוא אני צריך כתב על ידי BBS עיכול אחד, כמו לקבל את ניל, את החוק לווקטור הליניארי כדי ליצור את המבנה הסופי, אשר בו זמנית מבטא RNA מדריך ואת גרעין CAS תשע מקושר עם DSRIP שני כתב פלואורסצנטי.
חלק שני: בניית וקטור פילוח כתבנית רקומבינציה הומולוגית. לביטוי של חלבון מעניין. לדוגמה, האדם החזיק מעמד.
אתה רוצה לסנתז את רצף cDNA על ידי מקור מסחרי זיקה OST תג או התקפה נפוצה אחרת לטיהור של חלבון ניתן למזג את רצף cDNA. זכור לכלול את רצף הקונצנזוס הקזחי לפני תחילת cDNA. מתעכל על ידי אנזים הגבלת Asc1, וכמו לקבל את התקליטור ואת ההחדרה לתוך עמוד השדרה.
Vactor, כלומר pKhR26-IBFP מניב את המטרה הסופית לרכז את המיכל, כל אחד, KB של חמש זרועות הומולוגיות ראשוניות ושלוש זרועות הומולוגיות ראשוניות. ערכת השחקנים של הביטוי כוללת מקדם CG, מסעדת UST, אם אתה רוצה אזור Koonin מקושר איריס, אם כתב VFD וקרנות AC פולי. לבסוף באופק מיקוד וקטור באמצעות אנזימי חותך ייחודיים, כגון EcoR1 או BamH1, התקציר והמוצר מטוהרים בחנות מינוס 20 מעלות על הערות אלקטרופורציה.
מומלץ להשיג ריכוז גבוה של DNA וקטורי ליניארי. חלק שלישי: אלקטרופורציה של קווי מקרופאג' ותאי T להכין תרבית תאים בעקבות הפרדה לתאי Geritalk. צפיפות התאים האופטימלית הייתה כ-0.5 מיליון תאים ל-ML בזמן ההדבקה.
אלקטרופורציה מלאה בעשרה פורמטי טיפים לאופנה גרעינית מאקרו להכין צלחת 24 באר המכילה 500 microliter של צמיחה מלאה, בינוני ללא אנטיביוטיקה בכל באר. תחמם מראש את הלוחות ב-37 מעלות לחות, 5% מכסות את האינקובטור הזה. תנמיך את הפרמטרים של אלקטרופורציה קלט מערכת ההפעלה החשמלית עבור חתול סילון או Rosales.
הכן מעקבים אחר תערובת דנ"א של התא או מבצע לאסוף תאי עוף. קורצ'ין 25 ס"מ בקבוקון להעביר תאים ב 15 בעלי חיים. מאז שאתה צינור, אז פיליפ התאים על ידי צנטריפוגציה ב 90 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר, לבקש את זה, supernatants.
לשטיפה, resuspend התאים עם חמשת ה- ML PBS, ולאחר מכן לסובב את ההשעיה התא על ידי צנטריפוגה באמצעות אותו מצב כמו השלב הקודם. הסר את העקורים. וחידש את כריות התאים באמצעות שני ML של DBS.
אתה נשאר השעיית תא זעירה ומערבב עם נפח שווה של 0.2%Trepan Ballou כדי להעריך את דגימת עומס ספירת התא במונחים ספירת חריץ להכניס שקופית קוני בתא האוטומטי קונור ולהציג את התמונה עצמם. ואז לקבל תוצאה של ספירת תאים. חשב 2 מיליון תאים ימצאו מוניטין של אלקטרופורציה לניסוי דפיקות להעביר את מספר התאים לתוך 1.5 ML.Centrifuge שני תאים כדוריים על ידי צנטריפוגליזציה.
כדי לחסוך זמן, תערובת אלקטרופורציה ניתן להכין במהלך צנטריפוגליזציה המוסיפה 2.5 מיקרוגרם של כל אחד CRISPR CAS תשעה וקטור 2.4 מיקרוגרם של אורז בלינדה, וקטור פטפטן, ו- Re suspension באפלו. הנפח הכולל הכולל שלנו של 55 המלטה מאקרו בצינור צנטריפוגה חדש 1.5 ML קודקוד בעדינות ו. עומדים בקצרה לערבב היטב.
יש להשאיר את תערובת הלחץ של לוקסור ואת טמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר ספינינג כמו חלק, DTB הוא זה בעצם נתיך במשך 30 שניות נוספות, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר להשעות תאים על ידי הוספת פיפטה תערובת אלקטרופורציה מוכן למעלה ולמטה בעדינות. אלקטרופורציה ביקשה את מערבל אלקטרופורציה התא באמצעות 10 מיקרו קטן קצה הסיעה הגרעינית היה pipettes חשוב.
הימנע בועות אוויר במהלך ליטוף pi זה יעלה כשל electroplating. לחץ על התחל. לאחר מכן הפעולה מעבירה את המדגם לזמן מה.
ובכן של 24, לוחות היטב עם מראש להזהיר המדיום ברוטו לבצע את אותו לחץ חשמלי ונהלים כמו לעיל על ארבע הדגימות המשוכפלות הנותרות, בעדינות לטלטל את הצלחת כדי להבטיח אפילו התפלגות של התאים. לדגור על התאים באינקובטור של 37 מעלות במשך 48 עד 72 שעות. לפני מעשה, מיון תאים בשעה 24 שעות לאחר ההדבקה, לבחון את הביטוי של שיבוש שניים עבור כתב מסעדה באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט מנותקת מהנציג עבורנו עצמם מצביעה על כך האלקטרופורציה פועלת כראוי.
חלק 4: מיון תאים כדי לבודד תאים נוק-אין putative. לפני מיון התאים להתכונן, ב 96 לוחות היטב עם 150 מיקרו קטן של סוג התא מדיום ברוטו ספציפי לכל טוב להשתמש במקום מיקרו התחתון הלא נכון לתרבות ואת המקום מיקרו התחתון השטוח עבור כל התאים להעביר תאים לתוך FACS סטרילי כדי לשמור על הצינור על קרח ולשים את התיבה בנתיב דרך החלון, חיבור לחדר מיון התאים כאשר ממיין התאים המוגדר החל עם זרבובית 85 מיקרו מטר וקצב זרימה נמוך למיון תאי מערכת החיסון כדי להשיג הערכת תאים אופטימלית והישרדות לקחת דגימות מקודקוד החלון לעבור בקצרה, ולהעמיס את המדגם ברכישות. Champer להגדיר החלקה על עובדות עבור מיון תאים להגדיר תחילה משפכי מכירות עבור פיזור פורד ופיזור צד, ולאחר מכן להגדיר את תאי החיים על ידי השגת ערכת שיחות תאים שליליים אדומים.
לאחר מכן, הם מוצאים תאים בודדים חיים על ידי גטינג יחיד יחיד באמצעות FSC H לעומת FSE בלוק רב-מגוון. לבסוף הגדר שער עבור DSRs הרצוי 2 ו- B אם תת-אוכלוסין חיובי של וולוו, המציין תאים שהודבקו בהצלחה עם וקטור CRISPR ווקטור הכיס. אז 10 תאים בודדים בכל באר של 96, צלחת היטב בתוספת עם טרום המלחמה, מדיום הצמיחה המלא באמצעות מצב תקופה או מצב תא יחיד לאחר מיון דגירה 96, לוחות היטב בחממה תרבית התא להרחבת התא.
חלק 5: סינון של העלאת תאים חיוביים לאחר כשבועיים של התרחבות תאים לאחר ההישרדה, התאים בצלחת 48 באר מעריכים את הביטוי של BFP או ציטומטריית זרימה באמצעות חלק קטן של להתרבות עצמו באמצעות תאים סוג הקיר כאוכלוסיות תא שליטה שלילית, בעל אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים BFP נשמרים כדי למלא את תמצית האימות את ה- DNA הגנומי מהתאים שעלינו לבטא BFP מעביר את הדנ"א הגנומי המבודד על ידי PCR עם פריימרים המשתרעים על כל צד של הזרועות ההומולוגיות, כלומר אחד מאתר ראשי ברצף הגנומי, חיצוני לווקטור המטרה. הצד הנראה לדבר עם הווקטור בניסוי זה, התחזית בגודל של מוצר PCR מוגבר עם הראשי הוא 1.2 KV. ועם F שתיים ו R שתיים הוא 1.2 KB תוצאות ריצוף סנגר. אז מוצרי PCR מראים את הרצפים של כל צומת אינטגרציה המדגים את המיקום הנכון והדופק לתוך רוזה 26 לוקאס.
אני אומר כמו אימונו סופג מאפשר אימות של דפיקות נכונות ברמת החלבון חלק שש תוצאות מייצגות. כדוגמה, שפורסם במחקר הקודם, הבענו כי לקבל 45 מולקולות tack כי inter עם תג OSD, והיה 26 לוקוס בתאי T קופה לאחר מכן טקט דולר. אני מקבל 45 ומנהלי תקריות או משך למטה על ידי טיהור זיקה ונושא ספקטרומטריית מסה.
הם נתוני פרוטאומיקס חשפו אינטראקציה של תאי T. לכן מאגר מוצרים זה הקל מאוד על החיפוש אחר intercalators חדש כדי להדגיש את הפונקציה של חלבון נתון. מצגת טכנית זו הראתה כי על ידי התבטאות ארעית מוגברת לכל קו יצוק RFP עם הווקטור המדבר בא לידי ביטוי ו- BFP עבור רוזה 26 לוקוס.
יצרנו דפיקות של קווי תאים עם ביטוי גנים קבוע הן בתאי T והן במקרופגים, שקשה לבצעם במניפולציות גנטיות. שיטות והמלצות אלה חלות על כריס המותר בקביעות של מקטע DNA גדול למחקרים מכניסטיים של תאי מערכת החיסון, כגון לזיהוי חלבון, מחקר אינטראקציה עם חלבון.
