このプロトコルの目的は、蛍光レポーターの助けを借りて、マクロファージとT細胞株におけるCRISPR/Cas9媒介ノックイン実験を簡素化し、細胞の選別に影響を与えることである。ローザ26ローカスは、遺伝子導入のためのゲノム安全港湾部位として知られている。マウスの世界では、26軌跡、またはヒトのオルソログで、攻撃の有無にかかわらず目的のタンパク質を発現するのが普通です。
第1部:Rosa26ローカスを標的としたsgRNAの設計とプラスミド建設まず、マウスRosa26遺伝子からsgRNAを設計し、マウスゲノム情報学の配列とアンサンブルゲノムブラウザを用いて、マウスRosa26遺伝子のゲノム配列をダウンロードする。オンラインウェブツールCRISPORに移動し、Rosa26 Locusからの入力シーケンスの100ベースペアを貼り付けます。
次いで、例えば、筋筋マウス参照ゲノム2011のゲノムを選択する。次に、PAMの種類を選択し、spCas9によって認識される20bp NGG"PAMモチーフを使用してください。
[送信] をクリックします。特異性の高いスコア、高い得点、およびオフターゲットが少ないガイドを選択します。非効率的と示されたガイドは避けるべきです。
特に、重複するシーケンスを持つ2つのガイドを選択すると、報告されたノックイン効率が向上する可能性があります。暖かい食事シーケンスの場合は、前方違法と逆転違法を合成し、リンアリングし、因子にクローンする準備ができています。発現可能なVactorあたりの線形化された減少を準備することは、DSRIP 2つの蛍光レポーターと結合したガイドRNAとCAS 9核を同時に発現する最終構築物を生成する線形化されたベクターであるニールを得るような、BBS 1つの消化によってレポーターしなければならない。
第2部:相同組換えテンプレートとしてのターゲットベクトルの構築目的のタンパク質の発現のため。例えば、人間は続いた。
cDNA配列を、市販のソースとアフィニティーOSTタグまたはタンパク質の精製のために一般的に使用される攻撃によってcDNA配列を合成したい場合は、cDNA配列に融合させることができます。cDNAの開始前にカザックコンセンサスシーケンスを含めておいてください。Asc1制限酵素によって消化され、CDとインサートをバックボーンに取り込むのが好きです。
Vactorは、すなわちpKhR26-IBFP IBPが最終的なターゲティングを得て容器を濃縮し、それぞれ1つ、5つの素数および3つの素数相同腕のKB。VFDレポーターとポリACファンドの場合、表現キャストセットには、CGプロモーター、USTレストラン、クーニン地域をアイリスにリンクさせたい場合が含まれます。最後に、EcoR1やBamH1などのユニークなカッター酵素を使用したベクターをターゲットとする地平線上で、消化器と製品はエレクトロポレーションノートに20度を差し引いた店で精製されます。
高濃度の線形化ベクターDNAを得ることを推奨します。第3部:マクロファージとT細胞株のエレクトロポレーションは、ゲリトーク細胞の分離後の細胞培養を準備する。最適な細胞密度は、トランスフェクション時に1MLあたり約50万個の細胞であった。
10マクロ小さな核ファッションチップフォーマットの完全なエレクトロポレーションは、完全な成長の500マイクロリットル、各井戸に抗生物質のない培地を含む24ウェルプレートを準備します。プレートを加湿37度、5%がその設定インキュベーターを覆う前温め。ジェットキャットまたはロサレスの電気操作システム入力エレクトロポレーションパラメータを下げ
細胞DNA混合物のフォローアップを準備するか、または操作は鶏細胞を収集します。15匹の動物のカーチン25平方センチメートルフラスコ転写細胞。チューブするので、室温で8分間Gの90倍の遠心分離によって細胞をフィリップし、上清を求めます。
洗浄のために、5つのML PBSで細胞を再懸濁し、前のステップと同じ条件を使用して遠心分離によって細胞懸濁液を回転させる。DDP を削除します。そして、DBSの2つのMLを使用して細胞枕を再中断します。
マイクロリトルセルサスペンションを維持し、0.2%トレファンバロウの等しいボリュームと混合して、自動セルConnorのスロット挿入コニースライドをカウントする点でセルカウント負荷サンプルを推定し、画像自体を表示します。次に、セル数の結果を取得します。計算200万細胞は、1.5 ML.遠心分離によって2つのペレット細胞に細胞の数を移すノック実験ごとにエレクトロポレーションの評判を見つけるでしょう。
時間を節約するために、電気散液混合物は、ベリンダ米のCRISPR CAS 9ベクター2.4マイクログラム、おしゃべりベクター、および再懸濁水のそれぞれ2.5マイクログラムを加える遠心化の間に調製することができる。新しい1.5 ML遠心チューブの55マクロごみの総総量は穏やかに頂点を頂点にします。よく混ぜるために簡単に立ちます。
ルクソール圧力混合物と室温は使用前に放置してください。アスパートを紡糸した後、DTBは、この本質的に30秒間融合し、調製したエレクトロポレーション混合物ピペットを上下に加えることによってできるだけ多くの上清を除去し、細胞を徐々に下にする。10マイクロ小核派の先端を用いて細胞エレクトロポレーションミキサーを求めたエレクトロポレーションは、ピペットが重要であった。
piのふれあいの間に気泡を避け、電気めっきの故障を犠牲にします。開始ボタンを押します。その後、操作はしばらくの間サンプルを転送します。
24の井戸プレートは、総媒体が残りの4つの複製サンプルで上記と同じ電気圧力と手順を実行し、細胞の分布を均等にするためにプレートを穏やかに揺らします。細胞を48〜72時間インキュベーターで37度インキュベーターでインキュベートします。実際、細胞選別トランスフェクション後24時間で、私たち自身のために担当者から切り離された花性顕微鏡を使用してレストラン記者のための混乱2の発現を調べることは、エレクトロポレーションが正常に動作していることを示しています。
パート4:推定ノックイン細胞を分離する細胞の並べ替え。細胞選別準備の前に、150マイクロの細胞タイプ特異的なグロス培地を持つ96マイクロプレートでは、培養とそれ自体のための間違った底マイクロの場所を使用し、すべての細胞のためのフラットボトムマイクロの場所で、チューブを氷の上に保ち、窓を通して箱をパスに入れる無菌FACSに細胞を転送します。 最適な細胞の回避性を達成するために、85マイクロメートルノズルと低流量の免疫細胞選別でセルソーターを設定し、セルソーターに接続して、通過窓の頂点からサンプルを短時間で採取し、サンプルを集めます。Champerは、フォード散乱とサイドスキャッタの最初に定義された販売漏斗を定義したセルソートのためのファクトスケートを設定し、セットトーク赤負細胞を得ることによって生命細胞を定義します。
次に、FSC H 対 FSE を使用した単一単一の単一の細胞を多量多様ブロックで見つけます。最後に、細胞がCRISPRベクターとポケットベクターで正常にコトランスフェクトされたことを示すボルボ正の亜集団である場合、所望のDSR2とBのゲートを設定します。そこで96の各ウェルに10個の単細胞が、プリウォームを添加したプレートがよく、96を分別した後の期間モードまたは単細胞モードを用いて完全増殖培地を、細胞増殖のための細胞培養インキュベーター内のウェルプレート。
第5部:陽性ノックイン細胞の上昇のスクリーニング 生き残った後、48ウェルプレート内の細胞は、壁型細胞を負の対照細胞集団として使用してBFPまたはフローサイトメトリーの発現を評価し、BFP陽性細胞のより高い割合を有し、我々が発現すべき細胞からのゲノムDNAの検証抽出物を満たすために保持される。BFPは、同種腕の各側にまたがるプライマー、すなわちゲノム配列内の1つの一次位置を、標的ベクターに外面にしてPCRによって単離されたゲノムDNAを通過させる。この実験でベクターと話し合う側を見て、1次で増幅されたPCR産物のサイズが1.2KVであると予測した。そして、F 2とR 2は1.2 KBサンガーシーケンシング結果です。したがって、PCR産物は、Rosa 26ルーカスに正しい位置とノック位置を示す各統合接合部の配列を示しています。
私は免疫ブロッティングのように、タンパク質レベルの部分6の代表的な結果で正しいノックの検証を可能にします。前の研究で発表された例として、我々はOSDタグとのインターで45分子がタタックを得ることを表明し、その後USDタクトのチェックアウトT細胞に26の軌跡があった。私は45とインシデントディレクターを取得するか、アフィニティの浄化と質量分析の対象によって引き下げられます。
彼らはプロテオミクスデータがT細胞の相互作用を明らかにした。したがって、この製品プールは、特定のタンパク質の機能を解明するための新しいインターカレーターの探索を大いに容易にしました。この技術的なプレゼンテーションは、一過性発現によって、Rosa 26遺伝子座の共発現およびBFPとの共発現ベクトルとの一時的に発現した1つのキャストラインRFPあたりの増加を示した。
遺伝子操作では行いにくいT細胞とマクロファージの両方で、永久的な遺伝子発現を有するノッキング細胞株を生成しました。この方法と推奨事項は、タンパク質の同定、タンパク質相互作用研究など、免疫細胞の機械学的研究のために大きなDNAセグメントのアサーションで許可されたクリスに適用されます。
