פרוטוקול זה מציע שיטה למיפוי הכוחות המולקולריים הנוצרים על ידי תאים ובמיוחד תאים חיסוניים. הפרוטוקול הוא קריטי למעבדות המעוניינות לחקור מכנוטרנסדוקציה במכנוביולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה במיוחד ומאפשרת להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי כדי לכמת העברת כוח בתאים אימורטליים וראשוניים.
כדי להתחיל, הניחו כיסויים בקוטר 25 מ"מ על מתלה פוליטטרה-פלואוראתילן בכוס של 50 מיליליטר ושטפו את הכיסויים שלוש פעמים על ידי טבילתם במים. מערבבים כמויות שוות של אתנול ומים ומוסיפים 40 מיליליטר של תמיסה זו לכוס המכילה את המתלה ואת הכיסויים. לאחר מכן, אטמו את הכד באמצעות סרט פרפילם.
נקו את הכיסויים על ידי סוניקציה של הכד למשך 15 דקות בחומר ניקוי על-קולי והשליכו את הנוזל לאחר סוניקציה. לאחר מכן, שטפו את הכד המכיל את המתלה ומכסים אותו במים לפחות שש פעמים כדי להסיר את שאריות הממס האורגני. כדי להכין תמיסת פיראנה טרייה, להוסיף 30 מיליליטר של חומצה גופרתית לכוס 50 מיליליטר ולהוסיף לאט 10 מיליליטר של מי חמצן.
מערבבים בעדינות את תמיסת הפיראנה בעזרת קצה פיפטה מזכוכית. כדי להתחיל בחריטה, העבירו את המדף המחזיק את הכיסויים לכוס המכילה תמיסת פיראנה ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקות ולבצע הידרוקסילאט של החלקות הכיסוי. לאחר מכן, העבירו את המדף באמצעות פינצטה מפלדה או פוליטטרה-פלואוראתילן לכוס נקייה של 50 מיליליטר ושטפו במים שש פעמים.
על מנת להסיר מים לחלוטין, לטבול את המתלה המחזיק את הכיסויים בכוס 50 מיליליטר עם 40 מיליליטר אתנול. לאחר מכן, השליכו את האתנול. לאחר מכן, לטבול את המדף 40 מיליליטר של אתנול המכיל 3% aminopropyltriethoxysilane במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להתחיל את התגובה עם קבוצת hydroxyl על הכיסויים.
שוטפים את פני השטח של הכיסויים שש פעמים על ידי טבילתם ב -40 מיליליטר אתנול ומייבשים אותם בתנור ב 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כסו את החלק התחתון הפנימי של צלחת הפטרי בסרט פרפילם כדי למנוע מהכיסויים להחליק לתוך צלחת הפטרי. לאחר מכן הניחו את הכיסויים המכוסים באמין עם הצד כדי לתפקד עם בדיקות מתח DNA הפונות כלפי מעלה.
כסו את הכיסויים ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. כדי לשנות את קבוצות האמין על הכיסויים, הוסיפו חומצה ליפואית PEG NHS ו- mPEG NHS ודגרו על צלחת הפטרי בטמפרטורת החדר למשך שעה. בתום הדגירה שוטפים את פני השטח שלוש פעמים במים.
לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של 0.1 סודיום ביקרבונט מולארי המכיל מיליגרם אחד למיליליטר של Sulfo-NHS-אצטט לקבוצה של כיסויי סנדוויץ' לדגור במשך 30 דקות עבור פסיבציה להתרחש. הוסיפו 0.5 מיליליטר של ננו-חלקיקי זהב לכל כיסוי ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, יש לשטוף את הכיסויים במים שלוש פעמים.
לאחר הוספת גדיל Black Hole Quencher 2 לבדיקת מתח הדנ"א המחושלת ביחס של עשרה לאחד, הוסיפו 100 מיקרוליטר של התערובת לכל שני כיסויים כדי להכין את הכריך. הניחו בזהירות כדור רקמת מעבדה רטוב בצלחת הפטרי הרחק מהכיסויים ואטמו את הצלחת בסרט פרפילם כדי למנוע מהתמיסה להתייבש. לאחר מכן, מכסים את המנה בנייר כסף ודגרים עליה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת, הרכיבו את תא ההדמיה, תוך הקפדה על מניעת סדקים במשטח תוך הידוק החדר. לאחר מכן, הוסף 0.5 עד מיליליטר אחד של תמיסת המלח המאוזנת של האנק לתא ההדמיה. השתמש בערוץ Cy3B עם מטרה של 100X כדי ללכוד אותות פלואורסצנטיים של תאים המצופים על בדיקות המתח של סיכות השיער של הדנ"א כאשר הם מתחילים להתפשט.
לאחר הכנת מלאי גדיל נעילה לא פלואורסצנטי של 100 מיקרו-מולארי, בנקודת הזמן הרצויה, הוסף אותו לתאים בריכוז סופי של מיקרומולר אחד בתא ההדמיה כדי לאחסן את אות המתח ולערבב אותו עם התאים על ידי פיפטציה. לאחר כ-10 דקות של נעילה, רכשו סרטים בהילוך מהיר או תמונות של נקודות קצה באפיפלואורסנציה הן למיפוי מתח איכותי והן לניתוח כמותי. משטח מוצלח היה בצבע ורוד חיוור.
האיכות הגבוהה של פני השטח הודגמה עם רקע נקי ומיקרוסקופ ניגודיות הפרעות השתקפות או ערוץ RICM ועוצמת פלואורסצנטיות אחידה בערוץ Cy3B. תמונות בהילוך מהיר של נעילת מתח הצביעו על כך שגם אותות המתח TCR anti-CD3 epsilon וגם TCR-peptide-MHC הוגברו בגלל נעילת סיכות שיער והצטברות אותות. גדיל הנעילה תיעד אירועי משיכה מכניים קצרי מועד של פפטיד TCR MHCN4 החל מאפס דקות, מה שאפשר ניתוח כמותי וחשף את הדפוס המובהק של כוח MHC פפטיד TCR שדמה לדפוס בולזאיי של סינפסות חיסוניות.
בכל שלב, הכנת מצע הבדיקה שלך דורשת תשומת לב לפרטים וטיפול זהיר בחומרים. טכנולוגיה זו מאפשרת הדמיה של כוחות מולקולריים חולפים המתרחשים על פני התא כאשר הוא מתקשר עם הסביבה, במיוחד בתאי החיסון בחיפוש אחר אנטיגנים.
