Bu protokol, hücreler ve özellikle bağışıklık hücreleri tarafından üretilen moleküler kuvvetleri haritalamak için bir yöntem sunar. Protokol, mekanobiyolojide mekanotransdüksiyonu incelemek isteyen laboratuvarlar için kritik öneme sahiptir. Bu tekniğin temel avantajı, süper kolay olması ve ölümsüzleştirilmiş ve birincil hücrelerde kuvvet iletimini ölçmek için geleneksel floresan mikroskobunun kullanılmasına izin vermesidir.
Başlamak için, 25 milimetrelik kapak kaymalarını 50 mililitrelik bir beherdeki bir politetrafloroetilen rafa yerleştirin ve kapakları suya batırarak üç kez durulayın. Eşit miktarda etanol ve suyu karıştırın ve rafı ve kapakları içeren behere bu çözeltiden 40 mililitre ekleyin. Ardından, beheri parafilm bant kullanarak kapatın.
Beheri ultrasonik bir temizleyicide 15 dakika boyunca sonikleştirerek kapak fişlerini temizleyin ve sonikasyondan sonra sıvıyı atın. Ardından, rafı içeren kabı durulayın ve kalan organik çözücüyü çıkarmak için en az altı kez suyla örtün. Taze bir piranha çözeltisi hazırlamak için, 50 mililitrelik bir beher kabına 30 mililitre sülfürik asit ekleyin ve yavaşça 10 mililitre hidrojen peroksit ekleyin.
Bir cam pipetin ucunu kullanarak piranha çözeltisini yavaşça karıştırın. Aşındırmayı başlatmak için, kapak fişlerini tutan rafı piranha çözeltisi içeren beher kabına aktarın ve kapak kaymalarını temizlemek ve hidroksilleştirmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, rafı çelik veya politetrafloroetilen cımbız kullanarak 50 mililitrelik temiz bir behere aktarın ve altı kez suyla durulayın.
Suyu tamamen çıkarmak için, kapakları tutan rafı 40 mililitre etanol içeren 50 mililitrelik bir behere batırın. Ardından, etanol atın. Daha sonra, rafı% 3 aminopropiltrietoksisilan içeren 40 mililitre etanol içine oda sıcaklığında bir saat batırarak kapaklardaki hidroksil grubuyla reaksiyonu başlatın.
Kapakların yüzeyini 40 mililitre etanol içine batırarak altı kez durulayın ve 20 dakika boyunca 80 santigrat derecede bir fırında kurutun. Petri kabının iç tabanını bir parafilm bant ile örtün, böylece kapak kaymalarının Petri kabının içine kaymasını önleyin. Ardından, amin kaplı örtü kaymalarını, DNA gerilim probları yukarı bakacak şekilde işlevselleştirilecek tarafa yerleştirin.
Kapakları ileride kullanmak üzere 20 santigrat derecede örtün. Kapaklardaki amin gruplarını değiştirmek için, lipoik asit PEG NHS ve mPEG NHS ekleyin ve Petri kabını oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, yüzeyi üç kez suyla durulayın.
Bundan sonra, bir dizi sandviç kapağına mililitre başına bir miligram Sulfo-NHS-Asetat içeren 100 mikrolitre 0.1 molar sodyum bikarbonat ekleyin ve pasivasyonun gerçekleşmesi için 30 dakika inkübe edin. Her bir kapak parçasına 0.5 mililitre altın nanopartikül ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kapakları üç kez suyla durulayın.
Tavlanmış DNA gerilim probuna on ila bir oranında Kara Delik Quencher 2 ipliği ekledikten sonra, sandviçi yapmak için iki kapak fişi başına 100 mikrolitre karışım ekleyin. Islak bir laboratuvar mendil topunu Petri kabına dikkatlice örtülerden uzağa yerleştirin ve çözeltinin kurumasını önlemek için kabı parafilm bantla kapatın. Bundan sonra, çanağı bir folyo ile örtün ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, odayı sıkarken yüzey çatlamasını önlemeye özen göstererek görüntüleme odasını monte edin. Ardından, görüntüleme odasına 0,5 ila bir mililitre Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini ekleyin. Cy3B kanalını, yayılmaya başladıklarında DNA saç tokası gerilim problarına kaplanmış hücrelerin floresan sinyallerini yakalamak için 100X hedefiyle kullanın.
100 mikroMolar floresan olmayan kilitleme ipliği stoğu hazırladıktan sonra, istenen zaman noktasında, gerilim sinyalini depolamak ve pipetleme yoluyla hücrelerle karıştırmak için görüntüleme odasındaki son bir mikroMolar konsantrasyonunda hücrelere ekleyin. Yaklaşık 10 dakikalık kilitlemeden sonra, hem kalitatif gerilim haritalaması hem de kantitatif analiz için epifloresanda hızlandırılmış filmler veya son nokta görüntüleri elde edin. Başarılı bir yüzey soluk pembe bir renge sahipti.
Yüzeyin yüksek kalitesi, temiz bir arka plan ve yansıma girişimi kontrast mikroskobu veya RICM kanalı ve Cy3B kanalında homojen floresan yoğunluğu ile gösterilmiştir. Gerilim kilidinin hızlandırılmış görüntüleri, hem TCR anti-CD3 epsilon hem de TCR-peptid-MHC gerilim sinyallerinin, saç tokası kilitleme ve sinyal birikimi nedeniyle güçlendirildiğini göstermiştir. Kilitleme ipliği, TCR peptid MHCN4'ün sıfır dakikadan başlayarak kısa ömürlü mekanik çekme olaylarını kaydetti, bu da nicel analizi kolaylaştırdı ve TCR peptid MHC kuvvetinin bağışıklık sinapslarının boğa gözü modeline benzeyen farklı modelini ortaya çıkardı.
Her adımda, niyet probu substrat hazırlığınız, malzemelerin ayrıntılarına ve dikkatli bir şekilde kullanılmasına dikkat etmelidir. Bu teknoloji, özellikle antijen arayışındaki bağışıklık hücrelerinde, çevre ile etkileşime girdiğinde hücre yüzeyinde meydana gelen geçici moleküler kuvvetlerin görselleştirilmesini sağlar.
