Этот протокол предлагает метод картирования молекулярных сил, генерируемых клетками и, в частности, иммунными клетками. Протокол имеет решающее значение для лабораторий, заинтересованных в изучении механотрансдукции в механобиологии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он очень прост и позволяет использовать обычную флуоресцентную микроскопию для количественной оценки передачи силы в иммортализированных и первичных клетках.
Для начала поместите 25-миллиметровые покровные стекла на стойку из политетрафторэтилена в стакан объемом 50 миллилитров и трижды промойте покровные стекла, погрузив их в воду. Смешайте равные объемы этанола и воды и добавьте 40 миллилитров этого раствора в стакан, содержащий стойку и покровные стекла. Затем запечатайте стакан с помощью парапленочного скотча.
Очистите покровные стекла, обработав стакан ультразвуком в течение 15 минут в ультразвуковом очистителе и выбросьте жидкость после обработки ультразвуком. Затем промойте стакан, содержащий решетку и покровные стекла, водой не менее шести раз, чтобы удалить остатки органического растворителя. Чтобы приготовить свежий раствор пираньи, добавьте 30 миллилитров серной кислоты в стакан объемом 50 миллилитров и медленно добавьте 10 миллилитров перекиси водорода.
Аккуратно перемешайте раствор пираньи с помощью конца стеклянной пипетки. Чтобы начать травление, перенесите стойку, удерживающую покровные стекла, в стакан с раствором пираньи и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы очистить и гидроксилировать покровные стекла. Затем перенесите решетку с помощью стального или политетрафторэтиленового пинцета в чистый стакан объемом 50 миллилитров и промойте водой шесть раз.
Чтобы полностью удалить воду, погрузите стойку, удерживающую покровные стекла, в 50-миллилитровый стакан с 40 миллилитрами этанола. Затем выбросьте этанол. Затем погрузите стойку в 40 миллилитров этанола, содержащего 3% аминопропилтриэтоксисилана, на один час при комнатной температуре, чтобы начать реакцию с гидроксильной группой на покровных стеклах.
Промойте поверхность покровных стекол шесть раз, погрузив их в 40 миллилитров этанола, и высушите в духовке при температуре 80 градусов Цельсия в течение 20 минут. Накройте внутреннее дно чашки Петри парапленочной лентой, чтобы покровные стекла не скользили внутрь чашки Петри. Затем поместите покрытые амином покровные стекла стороной, которую нужно функционализировать, датчиками натяжения ДНК вверх.
Накройте покровные стекла при температуре 20 градусов Цельсия для использования впрок. Чтобы изменить аминогруппы на покровных стеклах, добавьте липоевую кислоту PEG NHS и mPEG NHS и инкубируйте чашку Петри при комнатной температуре в течение одного часа. По окончании инкубации трижды промойте поверхность водой.
После этого добавьте 100 микролитров 0,1-молярного бикарбоната натрия, содержащего один миллиграмм на миллилитр сульфо-NHS-ацетата, в набор сэндвич-покровных стекол и инкубируйте в течение 30 минут для пассивации. Добавьте 0,5 миллилитра наночастиц золота в каждое покровное стекло и выдерживайте в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации трижды промойте покровные стекла водой.
После добавления нити Black Hole Quencher 2 в отожженный зонд натяжения ДНК в соотношении десять к одному добавьте 100 микролитров смеси на два покровных стекла, чтобы получился сэндвич. Осторожно поместите влажный лабораторный шарик в чашку Петри подальше от покровных стекол и заклейте чашку парапленочной лентой, чтобы предотвратить высыхание раствора. После этого накройте блюдо фольгой и выдержите его при четырех градусах Цельсия в течение ночи.
На следующий день соберите камеру визуализации, позаботившись о том, чтобы предотвратить растрескивание поверхности при затягивании камеры. Затем добавьте от 0,5 до одного миллилитра сбалансированного солевого раствора Хэнка в камеру визуализации. Используйте канал Cy3B со 100-кратным объективом для захвата флуоресцентных сигналов клеток, нанесенных на натяжные зонды ДНК, когда они начинают распространяться.
После приготовления 100 мкмолярных нефлуоресцентных фиксирующих нитей в желаемый момент времени добавьте его в клетки в конечной концентрации один микромоль в камере визуализации, чтобы сохранить сигнал напряжения и смешать его с клетками путем пипетки. Примерно через 10 минут блокировки получите покадровые видеоролики или конечные изображения в эпифлуоресценции как для качественного картирования напряжения, так и для количественного анализа. Удачная поверхность имела бледно-розовый цвет.
Было продемонстрировано высокое качество поверхности с чистым фоном и отражательной интерференционно-контрастной микроскопией или каналом RICM и равномерной интенсивностью флуоресценции в канале Cy3B. Покадровые изображения блокировки натяжения показали, что сигналы напряжения TCR против CD3 эпсилона и TCR-пептида-MHC были усилены из-за фиксации шпильки и накопления сигнала. Блокирующая цепь регистрировала короткоживущие механические события вытягивания пептида TCR MHCN4, начиная с нуля минут, что облегчило количественный анализ и выявило отчетливую картину силы MHC пептида TCR, которая напоминала картину иммунных синапсов в яблочко.
На каждом этапе подготовки основания для зонда необходимо внимание к деталям и бережное обращение с материалами. Эта технология позволяет визуализировать переходные молекулярные силы, которые возникают на поверхности клетки, когда она взаимодействует с окружающей средой, особенно в иммунных клетках в поисках антигенов.
