يقدم هذا البروتوكول طريقة لرسم خريطة للقوى الجزيئية التي تولدها الخلايا وخاصة الخلايا المناعية. البروتوكول مهم للمختبرات المهتمة بدراسة النقل الميكانيكي في علم الأحياء الميكانيكي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة للغاية وتسمح للمرء باستخدام المجهر الفلوري التقليدي لتحديد انتقال القوة في الخلايا الخالدة والأولية.
للبدء ، ضع أغطية 25 ملم على رف بولي تترافلورو إيثيلين في دورق سعة 50 ملليلتر واشطف أغطية الغطاء ثلاث مرات عن طريق غمرها في الماء. امزج كميات متساوية من الإيثانول والماء وأضف 40 ملليلترا من هذا المحلول إلى الكأس الزجاجية التي تحتوي على الرف وأغطية الغطاء. ثم أغلق الدورق باستخدام شريط بارافيلم.
قم بتنظيف أغطية الغطاء عن طريق صوتنة الدورق لمدة 15 دقيقة في منظف بالموجات فوق الصوتية وتجاهل السائل بعد صوتنة. بعد ذلك ، اشطف الدورق الذي يحتوي على الرف وأغطية الأغطية بالماء ست مرات على الأقل لإزالة أي مذيب عضوي متبقي. لتحضير محلول سمكة البيرانا الطازج ، أضف 30 ملليلترا من حمض الكبريتيك إلى دورق 50 ملليلتر وأضف ببطء 10 ملليلتر من بيروكسيد الهيدروجين.
امزج محلول سمكة البيرانا برفق باستخدام نهاية ماصة زجاجية. لبدء الحفر ، انقل الرف الذي يحمل أغطية الغطاء إلى الدورق الذي يحتوي على محلول سمكة البيرانا واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتنظيف وهيدروكسيل أغطية الغطاء. بعد ذلك ، انقل الحامل باستخدام ملاقط فولاذية أو بولي تترافلورو إيثيلين إلى دورق نظيف سعة 50 مل واشطفه بالماء ست مرات.
لإزالة الماء تماما ، اغمر الرف الذي يحمل أغطية الغطاء في دورق سعة 50 ملليلتر مع 40 ملليلتر من الإيثانول. ثم تخلص من الإيثانول. بعد ذلك ، اغمر الحامل في 40 ملليلتر من الإيثانول الذي يحتوي على 3٪ أمينوبروبيل تريثوكسيسيلان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لبدء التفاعل مع مجموعة الهيدروكسيل على أغطية الغطاء.
شطف سطح أغطية ست مرات عن طريق غمرها في 40 ملليلتر من الإيثانول وتجفيفها في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بتغطية الجزء السفلي الداخلي من طبق بتري بشريط بارافيلم لمنع انزلاق الغطاء داخل طبق بتري. ثم ضع أغطية الغطاء المغطاة بالأمين بحيث يتم تشغيل الجانب مع مجسات شد الحمض النووي المتجهة لأعلى.
قم بتغطية أغطية الغطاء عند 20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. لتعديل مجموعات الأمين على أغطية الغطاء ، أضف حمض ليبويك PEG NHS و mPEG NHS واحتضان طبق بتري في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، شطف السطح ثلاث مرات بالماء.
بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 0.1 مولار تحتوي على ملليغرام واحد لكل ملليلتر من Sulfo-NHS-Acetate إلى مجموعة من أغطية الساندويتش واحتضانها لمدة 30 دقيقة حتى يحدث التخميل. أضف 0.5 ملليلتر من جزيئات الذهب النانوية إلى كل غطاء واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، شطف الغطاءزلات بالماء ثلاث مرات.
بعد إضافة حبلا Black Hole Quencher 2 إلى مسبار شد الحمض النووي الملدن بنسبة عشرة إلى واحد ، أضف 100 ميكرولتر من الخليط لكل غطاءين لصنع الساندويتش. ضع بعناية كرة مناديل معملية مبللة في طبق بتري بعيدا عن أغطية الغطاء وأغلق الطبق بشريط بارافيلم لمنع المحلول من الجفاف. بعد ذلك ، غطي الطبق بورق واحتضانه عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي ، قم بتجميع غرفة التصوير ، مع الحرص على منع تشقق السطح أثناء شد الغرفة. ثم أضف 0.5 إلى ملليلتر واحد من محلول الملح المتوازن هانك إلى غرفة التصوير. استخدم قناة Cy3B بهدف 100X لالتقاط إشارات الفلورسنت للخلايا المطلية على مجسات توتر دبوس شعر الحمض النووي عندما تبدأ في الانتشار.
بعد تحضير 100 ميكرومولار غير فلورسنت قفل حبلا ، في النقطة الزمنية المطلوبة ، أضفه إلى الخلايا بتركيز نهائي من ميكرو مولار واحد في غرفة التصوير لتخزين إشارة التوتر ومزجها مع الخلايا عن طريق الماصة. بعد حوالي 10 دقائق من القفل ، احصل على أفلام الفاصل الزمني أو صور نقطة النهاية في التألق لكل من رسم خرائط التوتر النوعي والتحليل الكمي. كان للسطح الناجح لون وردي باهت.
تم عرض الجودة العالية للسطح بخلفية نظيفة ومجهر تباين تداخل الانعكاس أو قناة RICM وشدة مضان موحدة في قناة Cy3B. أشارت صور الفاصل الزمني لقفل التوتر إلى أن إشارات التوتر TCR المضادة ل CD3 epsilon و TCR-peptide-MHC قد تم تضخيمها بسبب قفل دبوس الشعر وتراكم الإشارات. سجل حبلا القفل أحداث سحب ميكانيكية قصيرة العمر لببتيد TCR MHCN4 بدءا من صفر دقيقة ، مما سهل التحليل الكمي وكشف عن النمط المميز لقوة TCR الببتيد MHC التي تشبه نمط بولسي إي للمشابك المناعية.
في كل خطوة ، يحتاج إعداد ركيزة مسبار النية إلى الاهتمام بالتفاصيل والتعامل الدقيق مع المواد. تتيح هذه التقنية تصور القوى الجزيئية العابرة التي تحدث على سطح الخلية عندما تتفاعل مع البيئة ، خاصة في الخلايا المناعية التي تبحث عن المستضدات.
