이 프로토콜은 세포, 특히 면역 세포에서 생성된 분자력을 매핑하는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 기계 생물학에서 기계 변환을 연구하는 데 관심이 있는 실험실에 매우 중요합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 매우 쉽고 기존의 형광 현미경을 사용하여 불멸화 및 일차 세포에서 힘 전달을 정량화할 수 있다는 것입니다.
시작하려면 25밀리리터 비커의 폴리테트라플루오로에틸렌 랙에 50mm 커버슬립을 놓고 커버슬립을 물에 담가 세 번 헹굽니다. 같은 양의 에탄올과 물을 섞고 이 용액 40밀리리터를 랙과 커버슬립이 들어 있는 비커에 추가합니다. 그런 다음 파라필름 테이프를 사용하여 비커를 밀봉합니다.
초음파 세척기에서 15분 동안 비커를 초음파 처리하여 커버슬립을 청소하고 초음파 처리 후 액체를 버립니다. 그런 다음 랙과 커버슬립이 들어 있는 비커를 물로 6회 이상 헹구어 남아 있는 유기 용매를 제거합니다. 신선한 피라냐 용액을 준비하려면 50 밀리리터 비커에 30 밀리리터의 황산을 넣고 10 밀리리터의 과산화수소를 천천히 첨가하십시오.
유리 피펫의 끝을 사용하여 피라냐 용액을 부드럽게 혼합하십시오. 에칭을 시작하려면 커버슬립을 고정하는 랙을 피라냐 용액이 들어 있는 비커로 옮기고 실온에서 30분 동안 배양하여 커버슬립을 세척하고 하이드록실화합니다. 그런 다음 강철 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 핀셋을 사용하여 랙을 깨끗한 50밀리리터 비커로 옮기고 물로 6번 헹굽니다.
물을 완전히 제거하려면 커버슬립을 고정하는 랙을 50밀리리터의 에탄올이 든 40밀리리터 비커에 담그십시오. 그런 다음 에탄올을 버립니다. 다음으로, 실온에서 1시간 동안 3%아미노프로필트리에톡시실란을 함유한 40밀리리터의 에탄올에 랙을 담그고 커버슬립의 수산기와 반응을 시작합니다.
커버슬립의 표면을 에탄올 40밀리리터에 담가 6번 헹구고 섭씨 80도의 오븐에서 20분 동안 건조시킵니다. 페트리 접시의 내부 바닥을 파라필름 테이프로 덮어 커버슬립이 페트리 접시 내부로 미끄러지는 것을 방지합니다. 그런 다음 DNA 장력 프로브가 위를 향하도록 기능화할 측면이 위로 향하도록 아민으로 덮인 커버슬립을 놓습니다.
나중에 사용할 수 있도록 커버슬립을 섭씨 20도에서 덮으십시오. 커버슬립의 아민기를 수정하려면 리포산 PEG NHS와 mPEG NHS를 넣고 페트리 접시를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 표면을 물로 세 번 헹굽니다.
그 후, Sulfo-NHS-Acetate 밀리리터 당 1 밀리그램을 함유 한 0.1 몰 중탄산 나트륨 100 마이크로 리터를 샌드위치 커버 슬립 세트에 넣고 패시베이션이 일어나도록 30 분 동안 배양합니다. 각 커버 슬립에 0.5 밀리리터의 금 나노 입자를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 배양 후 커버 슬립을 물로 세 번 헹굽니다.
어닐링된 DNA 장력 프로브에 Black Hole Quencher 2 가닥을 10:1 비율로 추가한 후 커버슬립 2개당 혼합물 100마이크로리터를 추가하여 샌드위치를 만듭니다. 젖은 실험실 티슈 볼을 커버 슬립에서 멀리 떨어진 페트리 접시에 조심스럽게 놓고 용액이 마르지 않도록 파라필름 테이프로 접시를 밀봉합니다. 그 후, 접시를 호일로 덮고 섭씨 4도에서 밤새 배양하십시오.
다음 날, 이미징 챔버를 조립하고 챔버를 조이는 동안 표면 균열을 방지하도록 주의하십시오. 그런 다음 0.5 내지 1밀리리터의 Hank's Balanced Salt Solution을 이미징 챔버에 첨가한다. 100X 대물렌즈와 함께 Cy3B 채널을 사용하여 확산되기 시작할 때 DNA 헤어핀 장력 프로브에 도금된 세포의 형광 신호를 캡처합니다.
100 마이크로몰 비형광 잠금 스트랜드 스톡을 준비한 후, 원하는 시점에 이미징 챔버에서 1 마이크로몰의 최종 농도로 세포에 첨가하여 장력 신호를 저장하고 피펫팅으로 세포와 혼합합니다. 약 10분 동안 잠근 후 정성적 장력 매핑 및 정량 분석을 위해 에피형광으로 타임랩스 동영상 또는 종말점 이미지를 획득합니다. 성공적인 표면은 옅은 분홍색을 띠고있었습니다.
표면의 고품질은 깨끗한 배경과 반사 간섭 대비 현미경 또는 RICM 채널 및 Cy3B 채널에서 균일한 형광 강도로 입증되었습니다. 장력 잠금의 타임랩스 이미지는 TCR 항-CD3 엡실론과 TCR-펩티드-MHC 장력 신호가 모두 헤어핀 잠금 및 신호 축적으로 인해 증폭되었음을 나타냅니다. 잠금 가닥은 0분부터 시작하여 TCR 펩타이드 MHCN4의 수명이 짧은 기계적 당김 이벤트를 기록하여 정량 분석을 용이하게 하고 면역 시냅스의 과녁 패턴과 유사한 TCR 펩타이드 MHC 힘의 뚜렷한 패턴을 밝혀냈습니다.
모든 단계, 의도 프로브 기판 준비는 재료의 세부 사항과 신중한 취급에 주의를 기울여야 합니다. 이 기술을 사용하면 세포 표면이 환경과 상호 작용할 때, 특히 항원을 찾는 면역 세포에서 발생하는 일시적인 분자력을 시각화할 수 있습니다.
