本视频中描述的协议将定义传播细胞的真人大小成像所需的实验程序，以及使用计算工具，以公正和自动化的方式量化传播动态的细胞。细胞扩散资产允许在细胞扩散过程中持续跟踪细胞边缘运动和形态变化，这是大多数现有细胞扩散检测中缺失的一个特征。同时，本协议还实现了计算机自动处理和分析的使用，提供了关于细胞循环、区域和突出缩还周期的信息。
这种自动处理减少了数据分析中的偏差，并为大量细胞提供了分析细胞传播动力学的可靠方法。当与药物治疗或基因科学和技术相结合时，此协议可适应调节细胞突起的分子参与者的大规模速度。对于给定协议，使用的细胞是小鼠胚胎成纤维细胞，通过基因编码PH-Akt-GFP，允许荧光标记等离子膜。
在细胞展开检测之前，培养一盘细胞达到90%的共性。一旦细胞达到适当的对流，火焰22乘22毫米覆盖滑动，并将其放入35毫米细胞培养盘。涂上在PBS中稀释的纤维素，使盖片的浓度为每毫升2.5微克。
将带有盖子的盘子放入 37 度孵化器中一小时。一小时后，吸气纤维素，确保不要触摸与移液器尖端的盖滑。用PBS洗碗，轻轻在盖子周围吹两到三次。
对于细胞播种，首先从细胞盘中吸气细胞培养介质。之后，用温暖的PBS洗碗。在菜中加入 650 微升的 trypsin EDTA，使菜向倾斜，以均匀地分配酶。
将带试剂的菜放入孵化器中一分钟。孵化后，您首先需要将 10 毫升细胞培养介质添加到离心管中。接下来，快速在菜中加入另外10毫升的介质，以淬灭试穿素。
为了稀释将播种到盖滑上的细胞，将一毫升的菜肴内容放入离心管中。从管子上，移液器约500至1000微升稀释细胞进入菜中，盖滑。确保盖滑在 10% 的汇流或每毫升 5 万个细胞，并根据需要调整稀释细胞的体积。
这些细胞的目的是在图像采集过程中建立一个焦点平面。在盘中剩余的细胞中，每次处理将五分之一的细胞放入一个小盘子中。这些细胞将被分析为传播动力学。
将通道盘和盖滑盘放入孵化器中 8 至 24 小时。为了测试Arp2/3对细胞传播的重要性，首先在控制和治疗离心管中加入5毫升的细胞培养介质。接下来，在两个较大的离心管中各加入20毫升缺乏酚红色的 dmem。
派珀特要么药物CK-666，这是Arp2/3复合物的抑制剂或控制治疗，如DMSO到大小管。要开始对细胞进行药理治疗，取出在一夜之间孵育的通道盘。从所有菜肴中吸气细胞培养介质，用温暖的 PBS 洗碗。
将含有 CK-666 或控制补充介质的小管放入每个通道盘中，并将相关管子的内容添加到每个通道中。给每道菜贴上正确的药物治疗标签，然后将菜肴放回孵化器中一小时后再孵化一小时，从每道菜中吸气补充药物介质。接下来，在所有菜肴中加入温暖的 PBS，以便彻底去除所有剩余的酚红色介质。
加入230微升的特普辛EDTA，将菜肴放入孵化器中一分钟。从孵化器中取出试剂，然后将缺乏苯酚红的药物补充的五毫升加入指定为管 B 的管中，然后在相关菜中再加入五毫升相同介质，以淬火。将介质上下多次，以便将所有细胞从盘子中分离。
将菜的所有内容转移到另一个已被指定为管子的管子中，A.In 准备适合成像的细胞稀释，将一毫升细胞从A管转移到B管中。重复每次治疗的所有稀释步骤。将所有管子放入孵化器中45分钟，使细胞从尝试性化中恢复。确保可容纳 22 乘 22 毫米盖滑的细胞磁室的所有部分在使用前都经过彻底清洁。
用盖子从孵化器中取出盘子。吸气细胞培养介质，用温暖的 PBS 清洗封面滑。使用一对钳子取下盖滑，轻轻地将盖滑倒放在磁室的底部板上。
接下来拿起硅胶垫片，放在盖滑的顶部。将磁室的主体连接到底部板上。加入一毫升缺乏酚红色的 dmem，与磁室的相关处理相对应。
采取无绒组织，并仔细擦在主体和底部板之间的外壳，以检查任何泄漏。要完成磁室，将透明盖降低到主体上。最后用喷水的纸巾擦拭盖底，然后用70%乙醇喷洒另一块。
将共聚焦显微镜的舞台顶部孵化器预热至 37 度。将磁室放在目标顶部。在获取扩散动力学之前，将焦点放在绿色荧光通道中已经两极分化的细胞上。
这确保了扩散细胞在连接到盖滑时成为焦点。从从孵化器中取出的管 B 中取出磁室和移液器 500 微升的透明盖。将透明盖重新放在顶部。
为了识别适合细胞扩散分析的细胞，搜索绿色光环，这些光环代表尚未附着在盖滑上的细胞或处于附着的最初阶段的细胞。获取图像并保存文件。完成细胞传播的图像采集后，首先运行兼容的 Python IDE（如 Spyder）。
对于细胞传播动力学的计算分析，定位并打开相关脚本包中提供的细胞传播GUI文件。按下将打开后台分析GUI面板的运行按钮。GUI 提供分析所需的所有设置。
要分析细胞区域和循环，请输入采集文件和细胞传播区域选项卡中的必要设置。必须根据单元格类型和图像采集参数进行调整。按下运行后，脚本将为所有分布的单元创建细胞循环和区域与时间图。
有关基图数据，按下基图生成器和分析选项卡。此分析要求裁剪输入文件单单元格图像堆栈。在插入所有设置并按下运行后，脚本将为给定单元格创建多个基图。
左边是来自DMSO和CK-666治疗的代表性细胞，使用所提供的脚本自动分割。与对照细胞所表现出的同源和高度圆形形态相反，Arp2/3抑制细胞的循环性降低。此外，自动生成的基图提供时间分辨率，对于理解突起的动态至关重要。
控制细胞持续突出，几乎没有收回。相比之下，Arp2/3 抑制会破坏在整个传播过程中缩还事件增加所表明的突出的稳定性。这些视频应为您提供如何正确播种细胞、执行药理治疗以及准备细胞传播动力学量化所需的成像和计算工具的理解。
此协议可与细胞球菌荧光成像和迁移测定进一步结合，以确定控制细胞突起的分子参与者。谢谢你的观察和祝你的实验好运。
