O protocolo descrito neste vídeo definirá os procedimentos experimentais necessários para a imagem em tamanho real das células disseminadas e o uso de uma ferramenta computacional que quantifica as células espalhando dinâmicas de forma imparcial e automatizada. O ativo de disseminação de células permite o rastreamento contínuo do movimento da borda celular e alterações morfológicas durante a disseminação celular, que é uma característica que está faltando na maioria dos ensaios de propagação de células existentes. Além disso, este protocolo implementa o uso de processamento e análise automatizada de computadores, fornecendo informações sobre circularidade celular, ciclos de retração de área e saliência de células disseminantes.
Esse processamento automatizado reduz o viés na análise de dados e fornece um método robusto de analisar a dinâmica de disseminação celular para um grande número de células. Quando combinado com tratamentos medicamentosos ou ciência genética e técnicas, este protocolo é favorável a velocidades em larga escala de jogadores moleculares que regulam as saliências celulares. Para o protocolo dado, as células utilizadas são fibroblastos embrionários de camundongos que codificam geneticamente PH-Akt-GFP, o que permite a marcação fluorescente da membrana plasmática.
Antes do início do ensaio de propagação celular, cultura um prato de células para 90% de confluência. Uma vez que as células tenham atingido a confluência adequada, flame um deslizamento de cobertura de 22 por 22 milímetros e colocá-lo em um prato de cultura celular de 35 milímetros. Cubra o deslizamento com fibronectina que foi diluída em PBS a uma concentração de 2,5 microgramas por mililitro.
Coloque o prato com a tampa deslize em uma incubadora de 37 graus por uma hora. Após uma hora aspirar a fibronectina certificando-se de não tocar no deslizamento da tampa com a ponta da pipeta. Lave o prato com PBS, em pipetando suavemente ao redor da tampa, deslize duas a três vezes.
Para semeadura celular, comece aspirando a mídia de cultura celular a partir do prato das células. Depois, lave o prato com PBS quente. Adicione 650 microliters de trippsina EDTA ao prato e incline o prato para distribuir uniformemente a enzima.
Coloque o prato com o trypsin na incubadora por um minuto. Após a incubação, você precisará primeiro adicionar 10 mililitros de mídia de cultura celular em um tubo de centrífuga. Em seguida, adicione rapidamente mais 10 mililitros de mídia no prato, a fim de saciar o trypsin.
Para diluir as células que serão semeadas no deslizamento da tampa, pipeta um mililitro do conteúdo do prato no tubo centrífuga. Do tubo, pipeta aproximadamente 500 a 1.000 microliters de células diluídas no prato com o deslizamento de cobertura. Certifique-se de que o deslizamento da tampa está em uma confluência de 10% ou 50.000 células por mililitro e ajuste o volume de células diluídas conforme necessário.
O objetivo dessas células é estabelecer um plano de foco durante a aquisição de imagens. Com as células restantes no prato, passar um quinto das células em um prato pequeno por tratamento. Estas serão as células que serão analisadas para difundir dinâmicas.
Coloque os pratos de passagem e o prato de deslizamento de cobertura em uma incubadora por oito a 24 horas. Para testar a importância do Arp2/3 para a disseminação celular, primeiro adicione cinco mililitros de mídia de cultura celular em um controle e um tubo de centrífuga de tratamento. Em seguida, adicione 20 mililitros de dmem que está faltando vermelho fenol em cada um dos dois tubos de centrífuga maiores.
Pipeta ou a droga CK-666 que é um inibidor do complexo Arp2/3 ou o tratamento controlado como o DMSO nos tubos pequenos e grandes. Para iniciar o tratamento farmacológico das células, remova os pratos de passagem que estavam incubando durante a noite. Aspire a mídia de cultura celular de todos os pratos e lave os pratos com PBS quente.
Pegue os pequenos tubos contendo CK-666 ou controle a mídia suplementada e adicione o conteúdo do tubo relevante em cada um dos pratos de passagem. Rotule cada um dos pratos com o tratamento medicamentoso correto e, em seguida, coloque os pratos de volta na incubadora por mais uma hora Após uma hora de incubação, aspire a mídia suplementada da droga de cada um dos pratos. Em seguida, adicione PBS quente a todos os pratos, a fim de remover completamente todos os demais meios vermelhos de fenol.
Adicione 230 microliters de trippsina EDTA e coloque os pratos em uma incubadora por um minuto. Remova os pratos experimentpsinizados da incubadora e continue a adicionar cinco mililitros do dmem suplementado que está sem fenol vermelho em um tubo designado como tubo B.Em seguida, adicione mais cinco mililitros da mesma mídia no prato relevante para saciar a trippsina. Pipeta a mídia para cima e para baixo várias vezes, a fim de separar todas as células do prato.
Transfira todo o conteúdo do prato para outro tubo que já tenha sido designado como tubo A.In ordem para preparar uma diluição celular apropriada para a imagem, transfira um mililitro de células do tubo A para o tubo B.Repita todas as etapas de diluição para cada tratamento. Coloque todos os tubos na incubadora por 45 minutos para permitir que as células se recuperem da trippsinização. Certifique-se de que todas as partes de uma câmara magnética celular que possam acomodar um deslizamento de cobertura de 22 por 22 milímetros foram completamente limpas antes de usar.
Retire o prato com o deslizamento da tampa da incubadora. Aspire a mídia de cultura celular e lave o deslizamento da tampa com PBS quente. Remova o deslizamento da tampa usando um par de fórceps e coloque suavemente o deslizamento da tampa na placa inferior da câmara magnética.
Em seguida, pegue a junta de silicone e coloque-a em cima do deslizamento da tampa. Coloque o corpo principal da câmara magnética na placa inferior. Adicione um mililitro do dmem sem fenol vermelho correspondente ao tratamento relevante à câmara magnética.
Pegue um tecido sem fiapos e desça cuidadosamente o invólucro entre o corpo principal e a placa inferior, a fim de verificar se há vazamentos. Para completar a câmara magnética, baixe a tampa transparente sobre o corpo principal. Por fim, limpe o fundo da tampa com um tecido pulverizado com água e outro pulverizado com 70% de etanol.
Pré-aqueça a incubadora superior do estágio de um microscópio confocal a 37 graus. Coloque a câmara magnética em cima do objetivo. Antes de adquirir dinâmicas de difusão, defina o foco para as células já polarizadas no canal fluorescente verde.
Isso garante que as células que se espalham estarão em foco assim que se anexarem ao deslizamento da tampa. Remova a tampa transparente da câmara magnética e a pipeta 500 microliters do tubo B que foi removido da incubadora. Coloque a tampa transparente de volta por cima.
Para identificar células ideais para análise de propagação celular procure halos verdes que representem células que ainda não se anexaram ao deslizamento de cobertura ou estão nos estágios iniciais de apego. Adquira imagens e salve os arquivos. Depois de ter concluído a aquisição de imagem da expansão celular, comece executando um IDE Python compatível, como Spyder.
Para análise computacional da dinâmica de disseminação de células, localize e abra o arquivo de GUI de expansão celular fornecido nos pacotes de script relevantes. Pressione o botão executar que abrirá o painel de gui de análise em segundo plano. A GUI abriga todas as configurações necessárias para análise.
Para analisar a área da célula e a circularidade, insira o arquivo de aquisição e as configurações necessárias na guia da área de propagação da célula. Os ajustes terão que ser feitos dependendo do tipo de célula e dos parâmetros de aquisição de imagens. Após a pressão de execução, o script criará uma circularidade celular e uma parcela de área versus tempo para todas as células que espalham.
Para dados de kymograph, pressione o gerador de kymograph e a guia de análise. Esta análise requer que os arquivos de entrada sejam cortados em pilhas de imagens de célula única. Depois de inserir todas as configurações e pressionar a execução, o script criará vários kymogramas para a célula dada.
À esquerda estão células representativas dos tratamentos DMSO e CK-666, segmentados automaticamente usando o script fornecido. Ao contrário da morfologia isotropica e altamente circular demonstrada pelas células de controle, as células inibidas Arp2/3 apresentam diminuição da circularidade. Além disso, os kymogramas gerados automaticamente fornecem resolução temporal que é fundamental para entender a dinâmica das saliências.
As células de controle se projetam persistentemente com pouca ou nenhuma retração. Em contraste, a inibição de Arp2/3 interrompe a estabilidade das saliências, como indicado pelo aumento dos eventos de retração ao longo da propagação. Estes vídeos devem fornecer-lhe a compreensão de como seed adequadamente células, realizar tratamentos farmacológicos e preparar imagens e ferramentas computacionais necessárias para a quantificação da dinâmica de disseminação celular.
Este protocolo pode ser ainda mais combinado com imagens fluorescentes de citoesqueleto e ensaios de migração para identificar os atores moleculares que regem as saliências celulares. Obrigado por assistir e boa sorte com suas experiências.
