Il protocollo descritto in questo video definirà le procedure sperimentali necessarie per l'imaging a grandezza naturale delle cellule di diffusione e l'uso di uno strumento computazionale che quantifica le dinamiche di diffusione delle cellule in modo imparziale e automatizzato. La risorsa di diffusione cellulare consente il tracciamento continuo del movimento del bordo cellulare e dei cambiamenti morfologici durante la diffusione cellulare, che è una caratteristica che manca nella maggior parte dei test di diffusione cellulare esistenti. Anche questo protocollo implementa l'uso dell'elaborazione e dell'analisi automatizzata del computer, fornendo informazioni sulla circolarità cellulare, sui cicli di retrazione dell'area e della sporgenza delle cellule di diffusione.
Tale elaborazione automatizzata riduce la distorsione nell'analisi dei dati e fornisce un metodo robusto per analizzare la dinamica di diffusione delle cellule per un gran numero di celle. Se combinato con trattamenti farmacologici o scienze e tecniche geniche, questo protocollo è suscettibile a velocità su larga scala di lettori molecolari che regolano le sporgenze cellulari. Per il protocollo specificato, Le cellule utilizzate sono fibroblasti embrionali di topo che codificano geneticamente PH-Akt-GFP, che consente l'etichettatura fluorescente della membrana plasmatica.
Prima dell'inizio del test di diffusione della cellula, coltura di un piatto di cellule al 90% di confluenza. Una volta che le cellule hanno raggiunto la corretta confluenza, fiammare uno scivolo di copertura di 22 per 22 millimetri e posizionarlo in un piatto di coltura cellulare di 35 millimetri. Rivestire il coperchio con fibronectina che è stata diluita in PBS a una concentrazione di 2,5 microgrammi per millilitro.
Posizionare il piatto con il coperchio scivolare in un incubatore di 37 gradi per un'ora. Dopo un'ora aspirare la fibronectina assicurandosi di non toccare lo scivolo del coperchio con la punta della pipetta. Lavare il piatto con PBS tubazione delicatamente intorno al coperchio scivolare da due a tre volte.
Per la semina cellulare, iniziare aspirando il supporto di coltura cellulare dal piatto delle cellule. Successivamente, lavare il piatto con PBS caldo. Aggiungere 650 microlitri di tripside EDTA al piatto e inclinare il piatto per distribuire uniformemente l'enzima.
Posizionare il piatto con la triptina nell'incubatrice per un minuto. Dopo l'incubazione dovrai prima aggiungere 10 millilitri di mezzi di coltura cellulare in un tubo di centrifuga. Successivamente, aggiungere rapidamente altri 10 millilitri di supporto nel piatto per temprare la triptina.
Per diluire le cellule che verranno seminate sullo scivolo di copertura, pipettare un millilitro del contenuto del piatto nel tubo di centrifuga. Dal tubo, pipettare circa 500 a 1.000 microlitri di cellule diluite nel piatto con lo scivolo di copertura. Assicurarsi che lo slittamento del coperchio sia a una confluenza del 10% o 50.000 celle per millilitro e regolare il volume delle celle diluite in base alle esigenze.
Lo scopo di queste celle è quello di stabilire un piano di messa a fuoco durante l'acquisizione dell'immagine. Con le cellule rimanenti nel piatto, passare un quinto delle cellule in un piccolo piatto per trattamento. Queste saranno le cellule che verranno analizzate per diffondere la dinamica.
Posizionare i piatti di passaggio e la piastra di copertura in un'incubatrice per otto-24 ore. Per testare l'importanza dell'Arp2/3 per la diffusione cellulare, aggiungere prima cinque millilitri di mezzi di coltura cellulare in un tubo di controllo e centrifuga di trattamento. Aggiungere quindi 20 millilitri di dmem che manca di rosso fenolo in ciascuno dei due tubi di centrifuga più grandi.
Pipetta o il farmaco CK-666 che è un inibitore del complesso Arp2/3 o il trattamento controllato come DMSO nei tubi piccoli e grandi. Per iniziare il trattamento farmacologico delle cellule, rimuovere i piatti di passaggio che stavano incubando durante la notte. Aspirare i mezzi di coltura cellulare da tutti i piatti e lavare i piatti con PBS caldo.
Prendere i piccoli tubi contenenti CK-666 o controllare i supporti integrati e aggiungere il contenuto del tubo pertinente in ciascuna delle stoviglie di passaggio. Etichettare ciascuno dei piatti con il corretto trattamento farmacologico e quindi riposizionare i piatti nell'incubatrice per un'ora aggiuntiva Dopo un'ora di incubazione, aspirare il farmaco supporti integrati da ciascuno dei piatti. Quindi, aggiungere PBS caldo a tutti i piatti per rimuovere accuratamente tutti i restanti mezzi rosso fenolo.
Aggiungere 230 microlitri di tripside EDTA e posizionare i piatti in un'incubatrice per un minuto. Rimuovere i piatti tripsinici dall'incubatrice e procedere ad aggiungere cinque millilitri del farmaco integrato dmem che manca di rosso fenolo in un tubo designato come tubo B.Quindi aggiungere altri cinque millilitri dello stesso supporto nel piatto pertinente per temprare la tripanoina. Pipettare il supporto su e giù più volte per staccare tutte le cellule dal piatto.
Trasferire tutto il contenuto del piatto in un altro tubo che è già stato designato come tubo A.In modo da preparare una diluizione cellulare appropriata per l'imaging, trasferire un millilitro di cellule dal tubo A nel tubo B.Ripetere tutte le fasi di diluizione per ogni trattamento. Posizionare tutti i tubi nell'incubatore per 45 minuti per consentire alle cellule di riprendersi dalla tripsiinizzazione. Assicurarsi che tutte le parti di una camera magnetica cellulare in grado di ospitare uno slittamento di copertura di 22 per 22 millimetri siano state accuratamente pulite prima dell'uso.
Rimuovere il piatto con la lapsus dall'incubatrice. Aspirare il supporto di coltura cellulare e lavare la lapsus con PBS caldo. Rimuovere lo slittamento del coperchio utilizzando un paio di forcep e posare delicatamente il coperchio sulla piastra inferiore della camera magnetica.
Quindi prendi la guarnizione in silicone e posizionala sopra la slitta di copertura. Attaccare il corpo principale della camera magnetica sulla piastra inferiore. Aggiungere un millilitro del dmem privo di rosso fenolo corrispondente al trattamento pertinente alla camera magnetica.
Prendi un tessuto privo di pelucchi e tampona con cura l'involucro tra il corpo principale e la piastra inferiore per verificare eventuali perdite. Per completare la camera magnetica, abbassare il coperchio trasparente sul corpo principale. Infine pulire il fondo del coperchio scivolare con un tessuto spruzzato con acqua e un altro spruzzato con 70% di etanolo.
Preriscaldare l'incubatore superiore dello stadio di un microscopio confocale a 37 gradi. Posizionare la camera magnetica sopra l'obiettivo. Prima di acquisire dinamiche di diffusione, mettere a fuoco le cellule già polarizzate nel canale fluorescente verde.
Ciò garantisce che le cellule di diffusione siano a fuoco una volta attaccate allo slittamento del coperchio. Rimuovere il coperchio trasparente della camera magnetica e dei microlitri pipetta 500 dal tubo B che è stato rimosso dall'incubatore. Riposizionare il coperchio trasparente sopra.
Per identificare le cellule ideali per l'analisi della diffusione cellulare cercare aloni verdi che rappresentano cellule che devono ancora attaccarsi allo slittamento di copertura o che si trovano nelle prime fasi di attacco. Acquisire immagini e salvare i file. Dopo aver completato l'acquisizione dell'immagine della diffusione delle celle, inizia eseguendo un IDE Python compatibile come Spyder.
Per l'analisi computazionale della dinamica di diffusione delle celle, individuare e aprire il file GUI di diffusione delle celle fornito nei pacchetti di script pertinenti. Premere il pulsante Esegui che aprirà il pannello GUI di analisi in background. La GUI ospita tutte le impostazioni necessarie per l'analisi.
Per analizzare l'area delle celle e la circolarità, inserire il file di acquisizione e le impostazioni necessarie nella scheda area di diffusione cella. Le regolazioni dovranno essere effettuate a seconda del tipo di cella e dei parametri di acquisizione dell'immagine. Dopo aver premuto esegui, lo script creerà una circolarità cellulare e un grafico di area rispetto al tempo per tutte le celle di diffusione.
Per i dati del kymograph, premere il generatore di kymograph e la scheda di analisi. Questa analisi richiede che i file di input siano ritagliati in stack di immagini a cella singola. Dopo aver inserito tutte le impostazioni e premuto esegui, lo script creerà più cimografi per la cella data.
A sinistra ci sono cellule rappresentative dei trattamenti DMSO e CK-666, segmentate automaticamente utilizzando lo script fornito. A differenza della morfologia isotropa e altamente circolare dimostrata dalle cellule di controllo, le cellule inibite Arp2/3 mostrano una diminuzione della circolarità. Inoltre, i cimografi generati automaticamente forniscono una risoluzione temporale fondamentale per comprendere la dinamica delle sporgenze.
Le celle di controllo sporgono persistentemente con piccole o nessuna retrazione. Al contrario, l'inibizione dell'Arp2/3 interrompe la stabilità delle sporgenze come indicato dall'aumento degli eventi di retrazione durante la diffusione. Questi video dovrebbero fornirti la comprensione di come seminare correttamente le cellule, eseguire trattamenti farmacologici e preparare strumenti di imaging e computazionali necessari per la quantificazione della dinamica di diffusione cellulare.
Questo protocollo può essere ulteriormente combinato con l'imaging fluorescente del citoscheletro e i test di migrazione per identificare i lettori molecolari che governano le sporgenze cellulari. Grazie per la visione e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
