El protocolo descrito en este vídeo definirá los procedimientos experimentales necesarios para la toma de imágenes a tamaño natural de las células de dispersión y el uso de una herramienta computacional que cuantifica las células que difunden la dinámica de forma imparcial y automatizada. El activo de propagación celular permite el seguimiento continuo del movimiento del borde celular y los cambios morfológicos durante la propagación de la célula, que es una característica que falta en la mayoría de los ensayos de propagación de células existentes. Además, este protocolo implementa el uso de procesamiento y análisis informáticos automatizados, proporcionando información sobre la circularidad celular, el área y los ciclos de retracción de protuberancia de las células de dispersión.
Este procesamiento automatizado reduce el sesgo en el análisis de datos y proporciona un método robusto para analizar la dinámica de propagación de células para un gran número de celdas. Cuando se combina con tratamientos farmacológicos o ciencia y técnicas genéticas, este protocolo es apto para velocidades a gran escala de los jugadores moleculares que regulan las protuberancias celulares. Para el protocolo dado, las células utilizadas son fibroblastos embrionarios del ratón que codifican genéticamente PH-Akt-GFP, lo que permite el etiquetado fluorescente de la membrana plasmática.
Antes del comienzo del ensayo de propagación celular, cultiva un plato de células al 90% de confluencia. Una vez que las células hayan alcanzado la confluencia adecuada, llama a un resbalón de cubierta de 22 por 22 milímetros y colóquelo en un plato de cultivo celular de 35 milímetros. Cubra el resbalón de la cubierta con fibronectina que se ha diluido en PBS a una concentración de 2,5 microgramos por mililitro.
Coloque el plato con la cubierta en una incubadora de 37 grados durante una hora. Después de una hora aspirar la fibronectina asegurándose de no tocar el resbalón de la cubierta con la punta de la pipeta. Lave el plato con PBS pipendo suavemente alrededor de la tapa deslice de dos a tres veces.
Para la siembra celular, comience aspirando los medios de cultivo celular desde el plato de las células. Después, lave el plato con PBS caliente. Añadir 650 microlitros de trippsina EDTA al plato e inclinar el plato para distribuir uniformemente la enzima.
Coloque el plato con la trypsin en la incubadora durante un minuto. Después de la incubación primero tendrá que añadir 10 mililitros de medios de cultivo celular en un tubo centrífugo. A continuación, agregue rápidamente otros 10 mililitros de medios en el plato con el fin de apagar la trypsin.
Para diluir las células que se sembrarán en el deslizamiento de la cubierta, pipetear un mililitro del contenido del plato en el tubo centrífuga. Desde el tubo, pipeta aproximadamente 500 a 1.000 microlitros de células diluidas en el plato con el resbalón de la cubierta. Asegúrese de que el deslizamiento de la cubierta esté al 10% de confluencia o a 50.000 células por mililitro y ajuste el volumen de las células diluidas según sea necesario.
El propósito de estas celdas es establecer un plano de enfoque durante la adquisición de imágenes. Con las células restantes en el plato, pasa una quinta parte de las células a un plato pequeño por tratamiento. Estas serán las células que serán analizadas para la dinámica de propagación.
Coloque los platos de paso y la cubierta deslice el plato en una incubadora durante ocho a 24 horas. Para probar la importancia de Arp2/3 para la propagación celular, primero agregue cinco mililitros de medios de cultivo celular en un control y un tubo centrífuga de tratamiento. A continuación añadir 20 mililitros de dmem que carece de fenol rojo en cada uno de dos tubos centrífugos más grandes.
Pipeta ya sea el fármaco CK-666 que es un inhibidor del complejo Arp2/3 o el tratamiento controlado como DMSO en los tubos pequeños y grandes. Para comenzar el tratamiento farmacológico de las células, retire los platos de paso que estaban incubando durante la noche. Aspirar los medios de cultivo celular de todos los platos y lavar los platos con PBS caliente.
Tome los pequeños tubos que contienen CK-666 o controle los medios complementados y agregue el contenido del tubo pertinente en cada uno de los platos del pasaje. Etiqueta cada uno de los platos con el tratamiento farmacológico correcto y luego coloca los platos de nuevo en la incubadora durante una hora adicional Después de una hora de incubación, aspirar el medicamento complementado medios de cada uno de los platos. A continuación, añadir PBS caliente a todos los platos con el fin de eliminar a fondo todos los medios rojos fenol restantes.
Añadir 230 microlitros de trypsin EDTA y colocar los platos en una incubadora durante un minuto. Retire los platos trypsinizados de la incubadora y proceda a añadir cinco mililitros de la droga dmem suplementada que carece de fenol rojo en un tubo designado como tubo B.Then añadir otros cinco mililitros de los mismos medios en el plato pertinente para saciar la trippsina. Pipetear los medios arriba y abajo varias veces con el fin de separar todas las células del plato.
Transfiera todo el contenido del plato a otro tubo que ya ha sido designado como tubo A.In orden para preparar una dilución celular adecuada para la toma de imágenes, transfiera un mililitro de células del tubo A al tubo B.Repita todos los pasos de dilución para cada tratamiento. Coloque todos los tubos en la incubadora durante 45 minutos para permitir que las células se recuperen de la trippsinización. Asegúrese de que todas las partes de una cámara magnética celular que puede acomodar un resbalón de cubierta de 22 por 22 milímetros se hayan limpiado a fondo antes de su uso.
Retire el plato con el resbalón de la cubierta de la incubadora. Aspirar los medios de cultivo celular y lavar el resbalón de la cubierta con PBS caliente. Retire el resbalón de la cubierta con un par de fórceps y coloque suavemente el resbalón de la cubierta en la placa inferior de la cámara magnética.
A continuación, coja la junta de silicona y colóquela encima del resbalón de la cubierta. Coloque el cuerpo principal de la cámara magnética en la placa inferior. Añadir un mililitro del dmem carente de fenol rojo correspondiente al tratamiento pertinente a la cámara magnética.
Tome un tejido libre de pelusas y coloque cuidadosamente la carcasa entre el cuerpo principal y la placa inferior para comprobar si hay fugas. Para completar la cámara magnética, baje la cubierta transparente sobre el cuerpo principal. Por último, limpie la parte inferior de la tapa con un tejido rociado con agua y otro rociado con 70% de etanol.
Precaliente la incubadora superior del escenario de un microscopio confocal a 37 grados. Coloque la cámara magnética encima del objetivo. Antes de adquirir dinámicas de propagación, establezca el foco en las células ya polarizadas en el canal fluorescente verde.
Esto garantiza que las células que se extienden estarán enfocadas una vez que se adhieran al resbalón de la cubierta. Retire la cubierta transparente de la cámara magnética y la pipeta 500 microlitros del tubo B que se retiró de la incubadora. Coloque la cubierta transparente en la parte superior.
Para identificar las células ideales para el análisis de propagación celular, busque halos verdes que representen células que aún no se han adjunte al resbalón de la cubierta o se encuentran en las primeras etapas de unión. Adquiera imágenes y guarde los archivos. Después de haber completado la adquisición de imágenes de propagación de celdas, comience por ejecutar un IDE de Python compatible como Spyder.
Para el análisis computacional de la dinámica de propagación de celdas, busque y abra el archivo GUI de propagación de celdas proporcionado en los paquetes de script relevantes. Pulse el botón ejecutar que abrirá el panel GUI de análisis en segundo plano. La GUI alberga todos los ajustes necesarios para el análisis.
Para analizar el área de celda y la circularidad, introduzca el archivo de adquisición y la configuración necesaria en la pestaña área de dispersión de celda. Los ajustes deberán realizarse en función del tipo de celda y los parámetros de adquisición de imágenes. Después de presionar ejecutar, el script creará una circularidad de celda y un área frente a un gráfico de tiempo para todas las celdas de dispersión.
Para los datos del kymograph, presione el generador de kymograph y la pestaña de análisis. Este análisis requiere que los archivos de entrada se recorten pilas de imágenes de una sola celda. Después de insertar todos los ajustes y presionar ejecutar, el script creará varios kymographs para la celda dada.
A la izquierda hay células representativas de los tratamientos DMSO y CK-666, segmentadas automáticamente mediante el script proporcionado. A diferencia de la morfología isotrópica y altamente circular demostrada por las células de control, Arp2/3 células inhibidas exhiben disminución de la circularidad. Además, los kymographs generados automáticamente proporcionan una resolución temporal que es fundamental para comprender la dinámica de las protuberancias.
Las células de control sobresalen persistentemente con pequeñas o ninguna retracción. Por el contrario, la inhibición de Arp2/3 altera la estabilidad de las protuberancias, como lo indica el aumento de los eventos de retracción a lo largo de la propagación. Estos videos deben proporcionarle la comprensión de cómo sembrar correctamente las células, realizar tratamientos farmacológicos y preparar las herramientas de imagen y cálculo necesarias para la cuantificación de la dinámica de propagación celular.
Este protocolo se puede combinar aún más con imágenes fluorescentes de citoesqueleto y ensayos de migración para identificar a los jugadores moleculares que rigen las protuberancias celulares. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.
