城市环境 -环境水库SARS-CoV-2采样和检测管道

这项研究提出了一个新的工作流程，以检测SARS-CoV-2在城市环境中很少清洁的表面，如燃气泵手柄，游乐场和自动取款机。在一场大流行病中，供应短缺。我们使用在基本实验室环境中容易获得的材料、试剂和设备。

我们使用一种无需冷链即可保存RNA的提取方法，以及一种对抑制剂具有抗药性的检测方法。此协议符合公共卫生利益。它为评估当前COVID-19大流行和其他传染性物质的环境病毒库提供了一个框架，以应对未来全球疫情。

通过当地和社交媒体发布的直接和明确的行动呼吁招募公民科学家。创建社交媒体句柄，将主题跨社交媒体内容连接起来。创建指向 SMP 的链接，提供多语种插件，通过回答在线表格中指定的生物安全相关问题，使个人能够申请以多种语言进行导航，从而参与环境采样工作。

包括英语和西班牙语的采样部分图形和视听协议。使用云计算机服务提供商提供的地理空间应用程序编程界面可视化地理空间数据。通过 SMP 存储提交给 LIMS 的数据，以便于集中存储、跟踪处理工作流程和管理物流。

预加载信息（如样品套件 ID、示例 ID、日期、时间和全球定位系统坐标）可实现数据类型合规性并最大限度地减少错误。包括参与者的取样请求链接，他们可以在收集所有样本后使用该链接。构建包含所有取样用品的工具包，包括必要的个人防护设备，如口罩和手套、采样协议和生物安全相关信息。

Swab 很少通过用洗涤剂润湿一厘米见方聚酯吸水拭子和将表面平方 10 厘米擦拭来消毒家庭和城市环境中的表面。在牙签的帮助下，将每个样品拭子浸入预标记的含有200微升硫氰酸硅酸金的预标记管中。戴上提供的口罩和一副新手套，收集每个样品，以避免交叉污染。

完成取样后，使用所提供的洗手液。将管子存放在摄氏四度，直到它们被运到实验室。样品一到实验室，就储存在零下80摄氏度。

为了提高筛选速度，在池中处理样品。如果池为正，则独立提取每个样本的RNA。将每个取样包中的样品组合成两个池，将8个样品中的50微升放入微中管中，并将剩余样品保存在零下80摄氏度。

加入80微升氯仿和涡流15秒。然后在摄氏4度孵育20分钟。离心机在13，000倍G20分钟在4摄氏度。

将水层转移到新的微中流管中。将剩余的接口和粉红色液体存放在零下 80 摄氏度的冰柜中。这些分数包含DNA和蛋白质。

使用基于紫青酸酸钛的RNA粗提取协议从回收的液层中提取RNA。在室温下准备RT-LAMP反应组合，体积超过10%，以弥补管道损失。在样本反应中加入5微升RNA，在尖峰反应中加入5微升RNA，加入2.5微升合成SARS-CoV-2RNA。

在正控制中加入2.5微升合成SARS-CoV-2RNA，在负控制中加入5微升水。混合好，旋转下来的反应。对于彩色测量观测，阴性结果以粉红色表示，正结果以黄色表示。

RT-LAMP后，执行凝胶电泳。此处显示了样本收集站点的分布情况。大多数套件已完成，相应的数据已上传到 LIMS。

100%频率的检测限制为每25微升反应500份。在彩色RT-LAMP中，由于pH度从8变为5.5，阳性样品的颜色从粉红色变为黄色。在低拷贝数下，样品在 agarose 凝胶上运行，以确认与由此产生的梯状模式的阳性。

RT QPCR 方法通过环境样本进行了测试。所有主混合物对正控制低拷贝数浓度的抑制剂都很敏感。在模板的低浓度下，传统的RT PCR方法显示误报和假阴性。

最后，一种称为滚动圆放大的技术检测到目标序列的少量。但是，在没有 RNA 模板的情况下，它显示了探头的放大。至关重要的是，必须发出一项行动呼吁，使该社区的所有部门都能够真正代表该社区所有成员的接触风险。

该框架检测SARS-CoV-2遗传物质。测试病毒生存能力的研究是下一步。