Este estudo apresenta um novo fluxo de trabalho para detectar SARS-CoV-2 em superfícies raramente limpas no ambiente urbano, como alças de bomba de gás, playgrounds e caixas eletrônicos. Em uma pandemia, os suprimentos são escassos. Utilizamos materiais e reagentes facilmente obtidos e equipamentos disponíveis em ambientes básicos de laboratório.
Usamos um método de extração que preserva o RNA sem uma cadeia fria, e um método de detecção resistente aos inibidores. Este protocolo é de interesse da saúde pública. Fornece uma estrutura para a avaliação dos reservatórios virais ambientais para a atual pandemia COVID-19 e outros agentes infecciosos durante futuros surtos globais.
Recrute cientistas cidadãos usando uma chamada direta e clara para a ação liberada através de mídias locais e sociais. Crie uma alça de mídia social para conectar o assunto através do conteúdo das mídias sociais. Crie um link para o SMP, fornecendo um plug-in multilíngue para permitir a navegação em vários idiomas para que os indivíduos se inscrevam para participar do esforço de amostragem ambiental, respondendo perguntas relacionadas à biossegurança especificadas de forma online.
Inclua na seção de amostragem protocolos gráficos e audiovisuais em inglês e espanhol. Visualize dados geoespaciais usando uma interface de programação de aplicativos geoespacial facilitada por um provedor de serviços de computador em nuvem. Armazene os dados enviados ao LIMS através do SMP para facilitar o armazenamento centralizado, o acompanhamento dos fluxos de trabalho de processamento e o gerenciamento da logística.
Informações de pré-carga, como ID do kit de amostra, ID de amostra, data, hora e coordenadas do sistema de posicionamento global para permitir a conformidade do tipo de dados e minimizar o erro. Inclua um link de solicitação de coleta de amostras para os participantes, que eles podem usar depois de coletar todas as amostras. Construa um kit que contenha todos os suprimentos de amostragem, incluindo os equipamentos de proteção individual necessários, como máscara e luvas, um protocolo de amostragem e informações relevantes de biossegurança.
Swab raramente desinfetou superfícies em domicílios e no ambiente urbano, molhando um cotonete absorvente de poliéster quadrado de um centímetro quadrado com um detergente e limpando uma superfície de 10 centímetros ao quadrado. Auxiliado por um palito, submergir cada amostra no tubo pré-rotulado contendo 200 microliters de tiocianato de guanidinium. Use a máscara fornecida e um novo par de luvas para a coleta de cada amostra para evitar contaminação cruzada.
Após o término da amostragem, use o desinfetante para as mãos fornecido. Armazene os tubos a quatro graus Celsius até que sejam transportados para o laboratório. Uma vez que as amostras chegam ao laboratório, armazene-as a menos 80 graus Celsius.
Para aumentar a velocidade da triagem, processe as amostras em piscinas. Se uma piscina for positiva, extraia o RNA de cada amostra de forma independente. Combine as amostras de cada kit de amostragem em duas piscinas, agrupando 50 microlitadores de cada uma das oito amostras em um tubo de microcentrifuuge e salvando as amostras restantes a menos 80 graus Celsius.
Adicione 80 microliters de clorofórmio e vórtice por 15 segundos. Em seguida, incubar por 20 minutos a quatro graus Celsius. Centrífuga a 13.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Transfira a camada aquosa para um novo tubo de microcentrífuga. Armazene a interface restante e o líquido rosa no congelador de menos 80 graus Celsius. Estas frações contêm DNA e proteínas.
Extrair RNA da camada aquosa recuperada usando um protocolo de extração bruta de RNA à base de guanidinium. Prepare a mistura de reação RT-LAMP à temperatura ambiente com volume de 10% em excesso para explicar a perda de tubulação. Adicione cinco microliters de RNA à reação amostral e cinco microliters de RNA mais 2,5 microliters de RNA SARS-CoV-2 sintéticos à reação cravada.
Adicione 2,5 microliters de RNA SARS-CoV-2 sintéticos ao controle positivo e cinco microliters de água ao controle negativo. Misture bem e gire as reações. Para observação colorimétrica, um resultado negativo é indicado pelo rosa e um resultado positivo é indicado pelo amarelo.
Depois de RT-LAMP, realize a eletroforese de gel. A distribuição dos locais de coleta de amostras é mostrada aqui. A maioria dos kits estava completa, e os dados correspondentes foram enviados para o LIMS.
O limite de detecção em uma frequência de 100% foi de 500 cópias por 25 microliters de reação. Na RT-LAMP colorimétrica, as amostras positivas mudaram de cor de rosa para amarelo devido a uma mudança de pH de oito para 5,5. Em números baixos de cópia, as amostras foram executadas em um gel de agarose para confirmar os positivos com o padrão resultante da escada.
Os métodos RT QPCR foram testados com amostras ambientais. Todas as misturas mestras eram sensíveis aos inibidores em baixas concentrações numérias de cópia do controle positivo. Em baixas concentrações do modelo, os métodos tradicionais de RT PCR mostraram falsos positivos e falsos negativos.
Por fim, uma técnica chamada amplificação do círculo de rolamento detectou pequenas quantidades da sequência de destino. No entanto, mostrou amplificação da sonda na ausência de um modelo de RNA. É fundamental lançar um chamado à ação que atinja todos os setores da comunidade para que a amostragem represente verdadeiramente o risco de exposição de todos os membros dessa comunidade.
Esta estrutura detecta material genético SARS-CoV-2. Estudos para testar a viabilidade viral são o próximo passo.
