Diese Studie stellt einen neuartigen Workflow zum Nachweis von SARS-CoV-2 auf Oberflächen vor, die in der städtischen Umgebung selten gereinigt werden, wie z. B. Zapfsäulengriffe, Spielplätze und Geldautomaten. In einer Pandemie sind die Vorräte knapp. Wir verwenden leicht erhältliche Materialien und Reagenzien und Geräte, die in grundlegenden Laborumgebungen verfügbar sind.
Wir verwenden eine Extraktionsmethode, die die RNA ohne Kühlkette konserviert, und eine Nachweismethode, die gegen Inhibitoren resistent ist. Dieses Protokoll ist von Interesse für die öffentliche Gesundheit. Es bietet einen Rahmen für die Bewertung von umweltbedingten Virusreservoirs für die aktuelle COVID-19-Pandemie und andere Infektionserreger bei zukünftigen globalen Ausbrüchen.
Rekrutieren Sie Citizen Scientists mit einem direkten und klaren Aufruf zum Handeln, der über lokale und soziale Medien veröffentlicht wird. Erstellen Sie ein Social-Media-Handle, um das Thema über Social-Media-Inhalte hinweg zu verbinden. Erstellen Sie einen Link zum SMP und stellen Sie ein mehrsprachiges Plug-In bereit, um einzelpersonen die Navigation in mehreren Sprachen zu ermöglichen, indem sie Fragen zur biologischen Sicherheit beantworten, die in einem Online-Formular angegeben sind.
Fügen Sie im Sampling-Abschnitt grafische und audiovisuelle Protokolle in Englisch und Spanisch ein. Visualisieren Sie Geodaten mithilfe einer Geodaten-Anwendungsprogrammierschnittstelle, die von einem Cloud-Computerdienstanbieter unterstützt wird. Speichern Sie die über das SMP an das LIMS übermittelten Daten, um die zentrale Speicherung, die Verfolgung von Verarbeitungsworkflows und die Verwaltung der Logistik zu erleichtern.
Laden Sie Informationen wie Sample Kit ID, Sample ID, Datum, Uhrzeit und Koordinaten des globalen Positionierungssystems vor, um die Datentypkonformität zu ermöglichen und den Fehler zu minimieren. Fügen Sie einen Link zur Musterabholungsanforderung für die Teilnehmer ein, den sie verwenden können, sobald sie alle Proben gesammelt haben. Erstellen Sie ein Kit, das alle Probenahmematerialien enthält, einschließlich der erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung wie Maske und Handschuhe, eines Probenahmeprotokolls und für die biologische Sicherheit relevanter Informationen.
Tupfer desinfizierte selten Oberflächen in Haushalten und der städtischen Umgebung, indem ein ein Zentimeter quadratisch polyesterabsorbierender Tupfer mit einem Reinigungsmittel benetzt und eine Oberfläche von 10 Zentimetern im Quadrat abgetupfert wurde. Tauchen Sie mit Hilfe eines Zahnstochers jeden Probentupfer in das vormarkierte Röhrchen mit 200 Mikrolitern Guanidiniumthiocyanat. Tragen Sie die mitgelieferte Maske und ein neues Paar Handschuhe für die Entnahme jeder Probe, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Nachdem Sie die Probenahme abgeschlossen haben, verwenden Sie das mitgelieferte Händedesinfektionsmittel. Lagern Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius, bis sie ins Labor transportiert werden. Sobald die Proben im Labor angekommen sind, lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.
Um die Geschwindigkeit des Screenings zu erhöhen, verarbeiten Sie die Proben in Pools. Wenn ein Pool positiv ist, extrahieren Sie die RNA jeder Probe unabhängig voneinander. Kombinieren Sie die Proben aus jedem Probenahmekit zu zwei Pools, indem Sie 50 Mikroliter jeder der acht Proben in einem Mikrozentrifugenröhrchen zusammenfassen und die verbleibenden Proben bei minus 80 Grad Celsius speichern.
Fügen Sie 80 Mikroliter Chloroform und Wirbel für 15 Sekunden hinzu. Anschließend 20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Zentrifuge bei 13.000 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.
Die wässrige Schicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Bewahren Sie die restliche Schnittstelle und die rosa Flüssigkeit im minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank auf. Diese Fraktionen enthalten DNA und Proteine.
Extrahieren Sie RNA aus der wiederhergestellten wässrigen Schicht mit einem Guanidiniumthiocyanat-basierten RNA-Rohextraktionsprotokoll. Bereiten Sie die RT-LAMP-Reaktionsmischung bei Raumtemperatur mit 10% Übervolumen vor, um den Pipettierverlust zu berücksichtigen. Fügen Sie der Probenreaktion fünf Mikroliter RNA und der Spiked-Reaktion fünf Mikroliter RNA plus 2,5 Mikroliter synthetische SARS-CoV-2-RNA hinzu.
Fügen Sie 2,5 Mikroliter synthetische SARS-CoV-2-RNA zur Positivkontrolle und fünf Mikroliter Wasser zur Negativkontrolle hinzu. Mischen Sie gut und drehen Sie die Reaktionen herunter. Für die kolorimetrische Beobachtung wird ein negatives Ergebnis durch Rosa und ein positives Ergebnis durch Gelb angezeigt.
Führen Sie nach RT-LAMP eine Gelelektrophorese durch. Die Verteilung der Beispielsammelstellen ist hier dargestellt. Ein Großteil der Kits war vollständig und die entsprechenden Daten wurden in das LIMS hochgeladen.
Die Nachweisgrenze bei einer Frequenz von 100% betrug 500 Kopien pro 25 Mikroliter Reaktion. Im kolorimetrischen RT-LAMP änderten positive Proben aufgrund einer pH-Verschiebung von acht auf 5,5 die Farbe von rosa zu gelb. Bei niedrigen Kopienzahlen wurden Proben auf einem Agarosegel durchgeführt, um die Positiven mit dem resultierenden leiterartigen Muster zu bestätigen.
RT QPCR-Methoden wurden mit Umweltproben getestet. Alle Master-Mischungen waren empfindlich gegenüber Inhibitoren bei niedrigen Kopienzahlkonzentrationen der Positivkontrolle. Bei niedrigen Konzentrationen der Vorlage zeigten traditionelle RT-PCR-Methoden falsch positive und falsch negative Ergebnisse.
Schließlich erkannte eine Technik namens Rollkreisverstärkung kleine Mengen der Zielsequenz. Es zeigte jedoch eine Amplifikation der Sonde in Abwesenheit einer RNA-Vorlage. Es ist wichtig, einen Aufruf zum Handeln zu veröffentlichen, der alle Sektoren der Gemeinschaft erreicht, so dass die Stichprobe wirklich das Risiko der Exposition aller Mitglieder dieser Gemeinschaft darstellt.
Dieses Framework detektiert SARS-CoV-2 genetisches Material. Studien zum Testen der viralen Lebensfähigkeit sind der nächste Schritt.
