В этом исследовании представлен новый рабочий процесс для обнаружения SARS-CoV-2 на поверхностях, которые редко очищаются в городской среде, таких как ручки газовых насосов, игровые площадки и банкоматы. В условиях пандемии поставки ограничены. Мы используем легкодоступные материалы, реагенты и оборудование, доступные в основных лабораторных условиях.
Мы используем метод экстракции, который сохраняет РНК без холодовой цепи, и метод обнаружения, устойчивый к ингибиторам. Этот протокол представляет интерес для общественного здравоохранения. Он обеспечивает основу для оценки экологических вирусных резервуаров для текущей пандемии COVID-19 и других инфекционных агентов во время будущих глобальных вспышек.
Привлеките гражданских ученых, используя прямой и четкий призыв к действию, опубликованный через местные и социальные сети. Создайте дескриптор социальных сетей, чтобы связать тему с контентом социальных сетей. Создайте ссылку на SMP, предоставляя многоязычный плагин для обеспечения навигации на нескольких языках для отдельных лиц, чтобы подать заявку на участие в усилиях по отбору проб окружающей среды, ответив на вопросы, связанные с биобезопасностью, указанные в онлайн-форме.
Включите в раздел выборки графические и аудиовизуальные протоколы на английском и испанском языках. Визуализируйте геопространственные данные с помощью интерфейса геопространственного прикладного программирования, облегчаемого поставщиком облачных компьютерных услуг. Храните данные, отправленные в LIMS через SMP, чтобы облегчить централизованное хранение, отслеживание рабочих процессов обработки и управление логистикой.
Информация о предварительной загрузке, такая как идентификатор комплекта образцов, идентификатор образца, дата, время и координаты глобальной системы позиционирования, обеспечивает соответствие типам данных и сводит к минимуму ошибку. Включите ссылку запроса на получение образца для участников, которую они могут использовать после того, как они собрали все образцы. Создайте комплект, который содержит все материалы для отбора проб, включая необходимые средства индивидуальной защиты, такие как маска и перчатки, протокол отбора проб и информацию, относящуюся к биобезопасности.
Тампон редко дезинфицировал поверхности в домашних хозяйствах и городской среде, смачивая один сантиметр квадратного полиэфирового абсорбирующего тампона моющим средством и смазывая поверхность площадью 10 сантиметров в квадрате. С помощью зубочистки погрузьте каждый образец мазка в предварительно маркированную трубку, содержащую 200 микролитров тиоцианата гуанидиния. Наденьте предоставленную маску и новую пару перчаток для сбора каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
После завершения отбора проб используйте предоставленное дезинфицирующее средство для рук. Храните трубки при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока они не будут доставлены в лабораторию. Как только образцы поступят в лабораторию, храните их при минус 80 градусах Цельсия.
Чтобы увеличить скорость скрининга, обработайте образцы в бассейнах. Если пул положительный, извлеките РНК каждого образца независимо. Объедините образцы из каждого набора для отбора проб в два бассейна, объединив 50 микролитров каждого из восьми образцов в микроцентрифужную трубку и сохранив оставшиеся образцы при минус 80 градусах Цельсия.
Добавьте 80 микролитров хлороформа и вихря в течение 15 секунд. Затем инкубировать в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Центрифуга в 13 000 раз G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.
Перенесите водный слой в новую микроцентрифужную трубку. Храните оставшуюся часть раздела и розовую жидкость в морозильной камере при минус 80 градусах Цельсия. Эти фракции содержат ДНК и белки.
Экстрагировать РНК из восстановленного водного слоя с использованием протокола экстракции РНК на основе гуанидиния тиоцианата. Приготовьте реакционную смесь RT-LAMP при комнатной температуре с избыточным объемом 10% для учета потерь при пипете. Добавьте пять микролитров РНК к реакции образца и пять микролитров РНК плюс 2,5 микролитра синтетической РНК SARS-CoV-2 к шиповидной реакции.
Добавьте 2,5 микролитра синтетической РНК SARS-CoV-2 к положительному контролю и пять микролитров воды к отрицательному контролю. Хорошо перемешайте и раскрутите реакции. Для колориметрического наблюдения отрицательный результат обозначается розовым цветом, а положительный результат обозначается желтым.
После RT-LAMP выполняют гель-электрофорез. Распределение образцов сайтов сбора показано здесь. Большинство комплектов были полными, и соответствующие данные были загружены в LIMS.
Предел обнаружения на частоте 100% составлял 500 копий на 25 микролитр реакции. В колориметрическом RT-LAMP положительные образцы изменили цвет с розового на желтый из-за сдвига рН с восьми до 5,5. При низких числах копий образцы были запущены на агарозном гелевом для подтверждения положительных результатов с результирующим лестничным рисунком.
Методы RT QPCR были опробованы на образцах окружающей среды. Все мастер-миксы были чувствительны к ингибиторам при низких концентрациях числа копий положительного контроля. При низких концентрациях шаблона традиционные методы ОТ-ПЦР показывали ложноположительные и ложноотрицательные результаты.
Наконец, метод, называемый усилением скользящего круга, обнаружил небольшие количества целевой последовательности. Тем не менее, он показал усиление зонда в отсутствие шаблона РНК. Крайне важно выпустить призыв к действию, который охватил бы все слои общества, чтобы выборка действительно представляла риск воздействия на всех членов этого сообщества.
Эта структура обнаруживает генетический материал SARS-CoV-2. Исследования для проверки вирусной жизнеспособности являются следующим шагом.
