Questo studio presenta un nuovo flusso di lavoro per rilevare SARS-CoV-2 su superfici che vengono raramente pulite nell'ambiente urbano, come maniglie delle pompe di benzina, parchi giochi e sportelli bancomat. In una pandemia, le forniture sono scarse. Utilizziamo materiali e reagenti facilmente ottenibili e attrezzature disponibili in ambienti di laboratorio di base.
Utilizziamo un metodo di estrazione che preserva l'RNA senza catena del freddo e un metodo di rilevamento resistente agli inibitori. Questo protocollo è di interesse per la salute pubblica. Fornisce un quadro per la valutazione dei bacini virali ambientali per l'attuale pandemia di COVID-19 e di altri agenti infettivi durante i futuri focolai globali.
Recluta scienziati cittadini utilizzando un invito all'azione diretto e chiaro rilasciato tramite i media locali e sociali. Crea un handle di social media per connettere l'argomento tra i contenuti dei social media. Creare un collegamento all'SMP, fornendo un plug-in multilingue per consentire la navigazione in più lingue per consentire alle persone di candidarsi per partecipare allo sforzo di campionamento ambientale rispondendo alle domande relative alla biosicurezza specificate in un modulo online.
Includere nella sezione di campionamento protocolli grafici e audiovisivi in inglese e spagnolo. Visualizza i dati geospaziali utilizzando un'interfaccia di programmazione di applicazioni geospaziali facilitata da un provider di servizi cloud computer. Archiviare i dati inviati al LIMS tramite L'SMP per facilitare lo storage centralizzato, il monitoraggio dei flussi di lavoro di elaborazione e la gestione della logistica.
Pre-caricamento di informazioni quali l'ID del kit di esempio, l'ID di esempio, la data, l'ora e le coordinate del sistema di posizionamento globale per abilitare la conformità ai tipi di dati e ridurre al minimo l'errore. Includi un link per la richiesta di prelievo di esempio per i partecipanti, che possono utilizzare una volta raccolti tutti i campioni. Costruisci un kit che contenga tutte le forniture di campionamento, inclusi i necessari dispositivi di protezione individuale, come maschera e guanti, un protocollo di campionamento e informazioni rilevanti sulla biosicurezza.
Tampone raramente disinfettato superfici nelle famiglie e nell'ambiente urbano bagnando un tampone assorbente in poliestere quadrato di un centimetro con un detergente e tamponando una superficie di 10 centimetri squadrata. Aiutati da uno stuzzicadenti, immergere ogni tampone campione nel tubo preetichettato contenente 200 microlitri di tiocianato di guanidinio. Indossare la maschera fornita e un nuovo paio di guanti per la raccolta di ogni campione per evitare la contaminazione incrociata.
Dopo aver terminato il campionamento, utilizzare il disinfettante per le mani fornito. Conservare i tubi a quattro gradi Celsius fino a quando non vengono trasportati in laboratorio. Una volta che i campioni arrivano in laboratorio, conservali a meno 80 gradi Celsius.
Per aumentare la velocità dello screening, elaborare i campioni in pool. Se una piscina è positiva, estrarre l'RNA di ogni campione in modo indipendente. Unire i campioni di ciascun kit di campionamento in due piscine raggruppando 50 microlitri di ciascuno degli otto campioni in un tubo di microcentrifugo e salvando i campioni rimanenti a meno 80 gradi Celsius.
Aggiungere 80 microlitri di cloroformio e vortice per 15 secondi. Quindi incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Centrifuga a 13.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Trasferire lo strato acquoso in un nuovo tubo di microcentrifugo. Conservare l'interfaccia rimanente e il liquido rosa nel congelatore meno 80 gradi Celsius. Queste frazioni contengono DNA e proteine.
Estrarre l'RNA dallo strato acquoso recuperato utilizzando un protocollo di estrazione grezzo di RNA a base di tiocianato di guanidinio. Preparare la miscela di reazione RT-LAMP a temperatura ambiente con un volume in eccesso del 10% per tenere conto della perdita di pipettazione. Aggiungere cinque microlitri di RNA alla reazione del campione e cinque microlitri di RNA più 2,5 microlitri di RNA sintetico SARS-CoV-2 alla reazione a spillo.
Aggiungere 2,5 microlitri di RNA sintetico SARS-CoV-2 al controllo positivo e cinque microlitri di acqua al controllo negativo. Mescolare bene e far girare giù le reazioni. Per l'osservazione colorimetrica, un risultato negativo è indicato dal rosa e un risultato positivo è indicato dal giallo.
Dopo RT-LAMP, eseguire l'elettroforesi in gel. La distribuzione dei siti di raccolta di esempio è illustrata qui. La maggior parte dei kit erano completi e i dati corrispondenti sono stati caricati sul LIMS.
Il limite di rivelazione ad una frequenza del 100% era di 500 copie per 25 microlitri di reazione. Nella colorimetrica RT-LAMP, i campioni positivi hanno cambiato colore dal rosa al giallo a causa di uno spostamento del pH da otto a 5,5. A numeri di copia bassi, i campioni venivano eseguiti su un gel di agarosio per confermare gli aspetti positivi con il modello a scala risultante.
I metodi RT QPCR sono stati testati con campioni ambientali. Tutte le miscele master erano sensibili agli inibitori a basse concentrazioni di numero di copie del controllo positivo. A basse concentrazioni del modello, i metodi tradizionali RT PCR mostravano falsi positivi e falsi negativi.
Infine, una tecnica chiamata amplificazione del cerchio di laminazione ha rilevato piccole quantità della sequenza bersaglio. Tuttavia, ha mostrato l'amplificazione della sonda in assenza di un modello di RNA. È fondamentale pubblicare un invito all'azione che raggiunga tutti i settori della comunità, quindi il campionamento rappresenta davvero il rischio di esposizione di tutti i membri di quella comunità.
Questo quadro rileva il materiale genetico SARS-CoV-2. Gli studi per testare la vitalità virale sono il prossimo passo.
