该协议将允许研究人员回答有关电路内功能基础的连接和空间组织的神经元模式的重要问题。这种技术的主要优点是，它能够可视化位于完整三维组织深处的神经元形态。这种方法很简单，因此易于重现。
首次实验者应该能够自如地执行这种技术。为了获得高质量的数据，必须有一个透明的组织样本。适当的组织清晰度和清除技术的视觉演示将使结果易于重复。
首先，将水凝胶浸没的脑组织置于真空培养箱中，在37摄氏度和零下90千帕斯卡真空下放置三个小时。将管顶部拧下，以使真空正确形成。用PBS在室温下用轻轻摇动洗纸巾10分钟。
将聚合组织样品置于电泳室中，跟踪室内组织的方向。用随附的电泳SDS缓冲液填充腔室和储液槽。以70伏，一安培和35摄氏度的恒定电流每毫升组织运行样品约2小时。
定期检查样品，通过将其从腔室中取出并以相同的方向替换来充分清除脑组织。样品清除完成后，在室温下在PBS中洗涤过夜，尽可能经常用新鲜的PBS代替PBS。在PBS中进行最后洗涤后，在室温下用去离子水洗涤纸巾五分钟三次。
组织将变得不透明并可能扩张。在室温下将组织在折射率匹配溶液中孵育至少四小时。在孵育过程中，构建一个合适的壳室来对样品进行成像。
首先使用载玻片作为安装底座，然后放下橡胶或塑料垫片并用超级胶水固定它们，确保没有任何孔。将透明组织放入预先填充有折射率匹配溶液的安装室中。将玻璃盖玻片放在顶部并用指甲油密封，以牢固地安装纸巾。
通过直接在玻璃顶部添加一滴折射率匹配的安装溶液来成像该组织。要为厚度超过5毫米的组织构建大型组织成像室，请使用具有高壁的10厘米玻璃皿。在中心放置一个50毫升的锥形管，确保管的直径足够大，可以接受所用物镜的镜筒。
在水中加入3%琼脂糖，倒入玻璃盘和锥形管之间的空间中，然后冷却一小时。这将形成一个固体琼脂糖环。使用超级胶水将组织牢固地粘附在腔室底部，并用折射率匹配溶液填充腔室，除非从空气中保存并储存在四摄氏度下，否则可能会开始聚合。
使用共聚焦显微镜获取图像。打开所有相关的成像设备。将样品放在载物台上。
小心地接近带有物镜的浸入式介质，并形成连续的介质柱。使用落射荧光，找到合适的成像区域。首先设置分辨率和扫描速度设置。
如果使用共聚焦显微镜进行成像，请完全关闭针孔以获得最小的光学截面，从而获得最佳的Z分辨率。逐渐增加激光功率或传感器增益，直到获得具有高信噪比的合适图像。如果使用标准EGFP或tdTomato双色成像，请设置光收集设置。
根据观察到的组织起点和终点设置 Z 轴堆栈参数。根据所需的 Z 分辨率设置步长。较小的步长将产生更大的Z分辨率，但可能导致样品漂白。
当对图像采集设置感到满意时，采集图像。确保图像具有高信噪比，并显示结构的明显边界。图像采集后，使用分析软件中的嵌入式统计数据和分类脚本分析具有代表性的细胞形态。
收集的数据表明，与神经元1相比，神经元2具有比树突状结构更大的刺密度和更高的棘密度。为了证实这一结果，进行了标准的Scholl分析，该分析肯定了神经元2比神经元1更具树突复杂性，这表示在距离体细胞50至100微米处的Scholl交叉点数量增加。神经元1包含更大比例的棘，具有更多类似丝状的棘，是一种未成熟的脊柱亚型。
具有明确头部的棘，称为蘑菇棘，可能包含更发达和成熟的突触。因此，神经元2更成熟，成熟棘的密度更高。清除后，可以使用传统的免疫组织化学对组织块进行染色。
