Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, wichtige Fragen zu neuronalen Konnektivitätsmustern und räumlicher Organisation zu beantworten, die der Funktion innerhalb eines Schaltkreises zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung neuronaler Morphologien ermöglicht, die sich tief im intakten dreidimensionalen Gewebe befinden. Diese Methode ist unkompliziert und somit leicht reproduzierbar.
Erstexperimentatoren sollten sich bei der Durchführung dieser Technik wohl fühlen. Es ist unerlässlich, eine klare Gewebeprobe zu haben, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten. Die visuelle Demonstration geeigneter Gewebeklarheit und Clearing-Techniken ermöglicht leicht reproduzierbare Ergebnisse.
Zu Beginn legen Sie das hydrogelgetauchte Hirngewebe für drei Stunden bei 37 Grad Celsius mit minus 90 Kilopascal Vakuum in einen Vakuum-Inkubator. Lassen Sie die Rohroberseite abgeschraubt, damit sich das Vakuum richtig bilden kann. Waschen Sie das Gewebe mit PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.
Legen Sie die polymerisierte Gewebeprobe in die Elektrophoresekammer und verfolgen Sie die Ausrichtung des Gewebes in der Kammer. Füllen Sie die Kammer und das Reservoir mit dem mitgelieferten Elektrophorese-SDS-Puffer. Lassen Sie die Probe bei 70 Volt, einem Ampere und 35 Grad Celsius mit konstantem Strom für etwa zwei Stunden pro Milliliter Gewebe laufen.
Überprüfen Sie die Probe regelmäßig auf eine ausreichende Reinigung des Hirngewebes, indem Sie es aus der Kammer entfernen und in der gleichen Ausrichtung ersetzen. Nachdem die Probe fertig geklärt ist, waschen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur in PBS und ersetzen Sie das PBS so oft wie möglich durch frisches PBS. Nach der letzten Wäsche in PBS waschen Sie das Gewebe fünf Minuten lang in deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur dreimal.
Das Gewebe wird undurchsichtig und kann sich ausdehnen. Inkubieren Sie das Gewebe in der Brechungsindex-Matching-Lösung für mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur. Konstruieren Sie während der Inkubation eine geeignete Gehäusekammer, um die Probe abzubilden.
Beginnen Sie mit einem Glasschieber als Basis für die Montage, legen Sie dann entweder Gummi- oder Kunststoffabstandhalter ab und sichern Sie sie mit Sekundenkleber, um sicherzustellen, dass keine Löcher vorhanden sind. Legen Sie das durchsichtige Gewebe in die Montagekammer, die mit einer Brechungsindex-Matching-Lösung vorgefüllt ist. Montieren Sie das Gewebe sicher, indem Sie einen Glasdecker darauf legen und mit Nagellack versiegeln.
Stellen Sie sich dieses Gewebe vor, indem Sie einen Tropfen Brechungsindex-matching-Montagelösung direkt auf das Glas geben. Um eine große Gewebebildgebungskammer für Gewebe mit einer Dicke von mehr als fünf Millimetern zu konstruieren, verwenden Sie eine 10 Zentimeter große Glasschale mit einer hohen Wand. Platzieren Sie ein konisches 50-Milliliter-Rohr in der Mitte und stellen Sie sicher, dass der Durchmesser des Rohrs groß genug ist, um den Lauf der verwendeten Objektivlinse aufzunehmen.
Machen Sie 3% Agarose in Wasser und gießen Sie es in den Raum zwischen der Glasschale und dem konischen Rohr, dann lassen Sie es für eine Stunde abkühlen. Dies wird einen Ring aus fester Agarose bilden. Kleben Sie das Gewebe mit Sekundenkleber sicher auf den Boden der Kammer und füllen Sie die Kammer mit einer Brechungsindex-Matching-Lösung, die zu polymerisieren beginnen kann, es sei denn, sie wird aus der Luft konserviert und bei vier Grad Celsius gelagert.
Erfassen Sie das Bild mit einem konfokalen Mikroskop. Schalten Sie alle relevanten Bildgebungsgeräte ein. Stellen Sie die Probe auf die Bühne.
Nähern Sie sich den Immersionsmedien vorsichtig mit dem Ziel und bilden Sie eine kontinuierliche Mediensäule. Finden Sie mit Hilfe der Epifluoreszenz ein geeignetes Bildgebungsfeld. Legen Sie zunächst die Einstellungen für Auflösung und Scangeschwindigkeit fest.
Bei der Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop schließen Sie das Loch vollständig, um den kleinsten optischen Schnitt und damit die beste Z-Auflösung zu erhalten. Erhöhen Sie allmählich die Laserleistung oder den Sensorgewinn, bis ein geeignetes Bild mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis erhalten wird. Wenn Sie die Standard-EGFP- oder tdTomato-Zweifarbbildgebung verwenden, legen Sie die Einstellungen für die Lichtsammlung fest.
Stellen Sie die Z-Stack-Parameter basierend auf den beobachteten Start- und Endpunkten des Gewebes ein. Stellen Sie die Schrittweite basierend auf der gewünschten Z-Auflösung ein. Kleinere Schrittweiten führen zu einer höheren Z-Auflösung, können aber zu einer Probenbleiche führen.
Wenn Sie mit den Bildaufnahmeeinstellungen zufrieden sind, erfassen Sie das Bild. Stellen Sie sicher, dass das Bild ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist und deutliche Grenzen der Strukturen aufweist. Nach der Bildaufnahme wurde die repräsentative Zellmorphologie mit Hilfe eingebetteter Statistiken und Klassifikationsskripte innerhalb der Analysesoftware analysiert.
Die gesammelten Daten spiegeln wider, dass Neuron 2 eine größere als dendritische Struktur mit einer höheren Dichte an Stacheln im Vergleich zu Neuron 1 aufweist. Um dieses Ergebnis zu untermauern, wurde eine Standard-Scholl-Analyse durchgeführt, die bestätigt, dass Neuron 2 dendritisch komplexer ist als Neuron 1, was durch die erhöhte Anzahl von Scholl-Schnittpunkten bei 50 bis 100 Mikrometern vom Soma aus angezeigt wird. Neuron 1 enthält einen größeren Anteil an Stacheln mit filopodienartigeren Formen und ist ein unreifer Wirbelsäulensubtyp.
Stacheln mit definierten Köpfen, Pilzstacheln genannt, enthalten wahrscheinlich entwickeltere und reifere Synapsen. So ist Neuron 2 reifer mit einer höheren Dichte an reifen Stacheln. Nach der Klärung können die Gewebebrocken mit der traditionellen Immunhistochemie gefärbt werden.
