このプロトコルは、研究者が回路内で機能の根底にある接続性と空間組織のニューロンパターンに関する重要な質問に答えることを可能にする。この技術の主な利点は、無傷の3次元組織の奥深くに位置するニューロン形態の視覚化を可能にすることです。この方法は簡単で、簡単に再現できます。
初めての実験者は、この技術を実行して快適でなければなりません。高品質のデータを得るためには、透明な組織サンプルを持つことが不可欠です。適切な組織の明瞭さとクリア技術の視覚的なデモンストレーションは容易に再生可能な結果を可能にする。
まず、ヒドロゲル水没した脳組織を真空インキュベーターに3時間、マイナス90キロパスカル真空で摂氏37度に入れます。真空が正しく形成されるようにチューブトップを緩めておいてください。PBSで10分間、穏やかな揺れで室温で洗浄します。
重合した組織試料を電気泳動室に入れ、チャンバ内の組織の向きを追跡する。チャンバとリザーバに、供給された電気泳動SDSバッファーを充填します。サンプルを70ボルト、アンペア1個、摂氏35度で、一定の電流で1ミリリットルの組織で約2時間実行します。
チャンバーから取り出して同じ方向に置き換えることで、サンプルを定期的にチェックして十分な脳組織のクリアを行います。試料のクリアが終了した後、PBSを室温で一晩洗浄し、できるだけ頻繁にPBSを新鮮なPBSに交換します。PBSでの最後の洗浄に続いて、室温で5分間、脱イオン水で洗浄します。
組織は不透明になり、膨張する可能性があります。屈折率整合溶液中の組織を室温で少なくとも4時間インキュベートする。インキュベーション中に、サンプルを画像化するのに適したハウジングチャンバーを構築します。
取り付けのベースとしてガラススライドを使用して開始し、ゴムまたはプラスチックのスペーサーのいずれかを置き、穴がないことを確認し、スーパー接着剤でそれらを固定します。透明なティッシュを屈折率の一致解決で事前に満たされた土台の部屋に置く。ガラスカバースリップを上に置き、マニキュアで密封して、ティッシュをしっかりと取り付けます。
ガラスの上に直接屈折率一致付け取り付け溶液の滴を加えることによって、この組織を画像化します。厚さが5ミリメートルを超える組織用の大きな組織イメージングチャンバーを構築するには、壁が高い10センチメートルのガラス皿を使用します。50 ミリリットルの円錐形チューブを中央に配置し、チューブの直径が、使用する対物レンズのバレルを受け入れるのに十分な大きさであることを確認します。
水に3%アガロースを作り、ガラス皿と円錐形のチューブの間のスペースに注ぎ、1時間冷まします。これは固体アガロースのリングを形成します。スーパー接着剤を使用してチャンバーの底に組織をしっかりと接着し、空気から保存し、摂氏4度で保存しない限り、ポリマー化し始める屈折率一致溶液でチャンバーを充填します。
共焦点顕微鏡を用いて画像を取得します。関連するすべての画像機器をオンにします。サンプルをステージに置きます。
慎重に目的と浸漬メディアにアプローチし、メディアの連続カラムを形成します。蛍光を用いて、適切な画像分野を見つける。まず、解像度とスキャン速度の設定を行います。
共焦点顕微鏡を使用してイメージングする場合は、ピンホールを完全に閉じて最小の光学セクションを得て、したがって最良のZ解像度を得る。信号対雑音比が高い適切な画像が得られるまで、レーザーパワーまたはセンサーゲインを徐々に増加させます。標準のEGFPまたはtdTomato 2色イメージングを利用する場合は、ライトコレクション設定を行います。
組織の観測開始点と終点に基づいてZスタックパラメータを設定します。希望の Z 解像度に基づいてステップ サイズを設定します。ステップサイズを小さくするとZ解像度が大きくなりますが、サンプルの漂白につながる可能性があります。
画像取得設定に満足した場合は、画像を取得します。画像の信号対雑音比が高く、構造の境界が明確であることを確認します。画像取得後、代表的な細胞形態を、組み込み統計を用いて解析し、解析ソフトウェア内でスクリプトを分類した。
収集されたデータは、ニューロン2がニューロン1と比較して脊椎の密度が高い樹状構造よりも大きいことを反映しています。この結果を立証するために、標準的なショル分析が行われ、ニューロン2は、ソーマから50〜100マイクロメートルでショル交差点の増加数によって示されるようにニューロン1よりも樹状的に複雑であると断言した。ニューロン1は、より多くのフィロポディアのような形をした脊椎のより大きな割合を含み、未熟な脊椎サブタイプである。
定義された頭を持つ棘, キノコの棘と呼ばれます, おそらく、より発達し、成熟したシナプスが含まれています.したがって、ニューロン2は成熟した脊椎の密度が高いとより成熟している。クリア後、組織チャンクは、従来の免疫組織化学を用いて染色することができる。
