Этот протокол позволит исследователям ответить на важные вопросы о нейронных паттернах связности и пространственной организации, которые лежат в основе функции в цепи. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет визуализировать нейронные морфологии, расположенные глубоко внутри интактной трехмерной ткани. Этот метод прост и, следовательно, легко воспроизводится.
Экспериментаторам-новичкам должно быть комфортно выполнять эту технику. Крайне важно иметь четкий образец ткани, чтобы получить высококачественные данные. Визуальная демонстрация соответствующей прозрачности тканей и методов очистки позволит легко воспроизвести результаты.
Для начала поместите погруженную в гидрогель ткань мозга в вакуумный инкубатор на три часа при температуре 37 градусов Цельсия при вакууме минус 90 килопаскалей. Оставьте верхнюю часть трубки откручиваться, чтобы вакуум сформировался должным образом. Промыть салфетку PBS в течение 10 минут при комнатной температуре с легким встряхиванием.
Поместите полимеризованный образец ткани в камеру электрофореза, отслеживая ориентацию ткани внутри камеры. Заполните камеру и резервуар прилагаемым электрофорезным буфером SDS. Запустите образец при 70 вольтах, одном ампере и 35 градусах Цельсия с постоянным током в течение примерно двух часов на миллилитр ткани.
Периодически проверяйте образец на предмет достаточного очищения мозговой ткани, удаляя его из камеры и заменяя в той же ориентации. После того, как образец закончил очистку, промывайте его в PBS на ночь при комнатной температуре, заменяя PBS свежим PBS как можно чаще. После окончательной промывки в PBS промыть ткань в течение пяти минут в деионизированной воде комнатной температуры три раза.
Ткань станет непрозрачной и может расширяться. Инкубируют ткань в растворе, соответствующем рефракционному индексу, в течение не менее четырех часов при комнатной температуре. Во время инкубации сконструировать подходящую камеру корпуса для изображения образца.
Начните с использования стеклянной горки в качестве основы для монтажа, затем положите резиновые или пластиковые распорки и закрепите их суперклеем, убедившись, что нет никаких отверстий. Поместите прозрачную ткань в монтажную камеру, предварительно заполненную раствором для согласования показателей преломления. Надежно скрепите ткань, поместив сверху стеклянную крышку и запечатав ее лаком для ногтей.
Изобразите эту ткань, добавив каплю соответствующего показателя преломления монтажного раствора непосредственно поверх стекла. Чтобы построить большую камеру визуализации тканей для тканей толщиной более пяти миллиметров, используйте стеклянную тарелку размером более 10 сантиметров с высокой стенкой. Поместите 50-миллилитровую коническую трубку в центр, убедившись, что диаметр трубки достаточно велик, чтобы принять ствол используемой объектива.
Внесите 3% агарозы в воду и вылейте ее в пространство между стеклянной посудой и конической трубкой, затем дайте ей остыть в течение одного часа. Это сформирует кольцо твердой агарозы. Надежно приклейте ткань к нижней части камеры с помощью суперклея и заполните камеру раствором для согласования показателей преломления, который может начать полимеризоваться, если его не сохранить из воздуха и не хранить при четырех градусах Цельсия.
Получите изображение с помощью конфокального микроскопа. Включите все соответствующее оборудование для обработки изображений. Поместите образец на сцену.
Тщательно подойдите к погружным средам с целью и сформируйте непрерывную колонку медиа. Используя эпифлуоресценцию, найдите подходящее поле визуализации. Начните с установки разрешения и настроек скорости сканирования.
При визуализации с использованием конфокального микроскопа полностью закройте точечное отверстие, чтобы получить наименьшее оптическое сечение и, следовательно, лучшее разрешение Z. Постепенно увеличивайте мощность лазера или усиление датчика до тех пор, пока не будет получено подходящее изображение с высоким отношением сигнал/шум. При использовании стандартной двухцветной визуализации EGFP или tdTomato установите параметры сбора света.
Установите параметры Z-стека на основе наблюдаемых начальной и конечной точек ткани. Установите размер шага в зависимости от требуемого разрешения Z. Меньшие размеры шагов приведут к большему разрешению Z, но могут привести к отбеливанию образца.
Когда вы удовлетворены настройками получения изображения, получите изображение. Убедитесь, что изображение имеет высокое отношение сигнал/шум и показывает четкие границы структур. После получения изображения репрезентативную морфологию клеток анализировали с использованием встроенной статистики и скриптов классификации в программном обеспечении для анализа.
Собранные данные отражают, что нейрон 2 имеет более крупную, чем дендритная структура, с более высокой плотностью шипов по сравнению с нейроном 1. Чтобы обосновать этот результат, был проведен стандартный анализ Шолля, который утверждает, что нейрон 2 более дендритически сложен, чем нейрон 1, что обозначается увеличением числа пересечений Шолля на 50-100 микрометрах от сомы. Нейрон 1 содержит большую долю шипов с более филоподийоподобными формами и является незрелым подтипом позвоночника.
Шипы с очерченными головками, называемые грибными шипами, вероятно, содержат более развитые и зрелые синапсы. Таким образом, нейрон 2 является более зрелым с более высокой плотностью зрелых шипов. После очистки куски ткани могут быть окрашены с помощью традиционной иммуногистохимии.
