Este protocolo permitirá que os pesquisadores respondam a perguntas importantes sobre padrões neuronais de conectividade e organização espacial que fundamentam a função dentro de um circuito. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização de morfologias neuronais localizadas profundas dentro do tecido tridimensional intacto. Este método é simples e, portanto, facilmente reproduzível.
Os experimentadores iniciantes devem estar confortáveis em executar esta técnica. É imprescindível ter uma amostra de tecido claro para obter dados de alta qualidade. A demonstração visual de técnicas adequadas de clareza tecidual e de compensação permitirá resultados facilmente reprodutíveis.
Para começar, coloque o tecido cerebral submerso de hidrogel em uma incubadora de vácuo por três horas a 37 graus Celsius com menos 90 quilopascal de vácuo. Deixe a parte superior do tubo desparafusada para permitir que o vácuo se forme corretamente. Lave o tecido com PBS por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.
Coloque a amostra de tecido polimerizado na câmara de eletroforese, acompanhando a orientação do tecido dentro da câmara. Encha a câmara e o reservatório com o tampão SDS de eletroforese fornecido. Execute a amostra a 70 volts, um ampere e 35 graus Celsius com corrente constante por cerca de duas horas por mililitro de tecido.
Verifique periodicamente a amostra quanto a limpeza do tecido cerebral, removendo-a da câmara e substituindo-a na mesma orientação. Depois que a amostra terminar de limpar, lave-a em PBS durante a noite à temperatura ambiente, substituindo o PBS por PBS fresco o mais frequentemente possível. Após a lavagem final na PBS, lave o tecido por cinco minutos em água deionizada à temperatura ambiente três vezes.
O tecido ficará opaco e pode se expandir. Incubar o tecido na solução de correspondência de índices de refração por pelo menos quatro horas em temperatura ambiente. Durante a incubação, construa uma câmara de habitação adequada para a imagem da amostra.
Comece usando um slide de vidro como base para montagem, em seguida, deite borracha ou espaçadores plásticos e fixe-os com super cola, certificando-se de que não há nenhum furo. Coloque o tecido claro na câmara de montagem pré-preenchido com solução de correspondência de índice refrativo. Montar o tecido com segurança colocando uma mancha de vidro em cima e selando-o com esmalte.
Imagem deste tecido adicionando uma gota de índice de refração combinando solução de montagem diretamente em cima do vidro. Para construir uma grande câmara de imagem tecidual para tecidos com mais de cinco milímetros de espessura, use uma antena de vidro de 10 centímetros com uma parede alta. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros no centro, certificando-se de que o diâmetro do tubo é grande o suficiente para aceitar o barril da lente objetiva utilizada.
Faça 3% de agarose na água e despeje-o no espaço entre o prato de vidro e o tubo cônico, em seguida, deixe esfriar por uma hora. Isso formará um anel de agarose sólida. Adere firmemente o tecido ao fundo da câmara usando super cola e encha a câmara com solução de correspondência de índice refrativo, que pode começar a polimerizar a menos que seja preservada do ar e armazenada a quatro graus Celsius.
Adquira a imagem usando um microscópio confocal. Ligue todos os equipamentos de imagem relevantes. Coloque a amostra no palco.
Aproxime cuidadosamente os meios de comunicação de imersão com o objetivo e forme uma coluna contínua de mídia. Usando epifluorescência, encontre um campo de imagem apropriado. Comece definindo as configurações de resolução e digitalização de velocidade.
Se a imagem usar um microscópio confocal, feche totalmente o pinhole para obter a menor seção óptica e, portanto, a melhor resolução Z. Aumente gradualmente a potência do laser ou o ganho do sensor até que uma imagem adequada seja obtida com uma alta relação sinal-ruído. Se utilizar imagens padrão de EGFP ou tdTomato de duas cores, defina as configurações da coleta de luz.
Defina os parâmetros de pilha Z com base nos pontos de partida e extremidade observados do tecido. Defina o tamanho da etapa com base na resolução Z desejada. Tamanhos de passo menores produzirão uma resolução Z maior, mas podem levar ao branqueamento amostral.
Quando estiver satisfeito com as configurações de aquisição de imagens, adquira a imagem. Certifique-se de que a imagem tem uma alta relação sinal-ruído e mostra limites distintos de estruturas. Após a aquisição de imagens, a morfologia celular representativa foi analisada utilizando estatísticas incorporadas e classificando scripts dentro do software de análise.
Os dados coletados refletem que o Neurônio 2 tem estrutura maior que a dendrítica com maior densidade de espinhas em comparação com o Neurônio 1. Para comprovar esse resultado, foi realizada a análise padrão de Scholl, que afirma que o Neurônio 2 é mais dendriticamente complexo que o Neurônio 1, conforme denotado pelo aumento do número de intersecções de Scholl a 50 a 100 micrômetros da soma. O neurônio 1 contém uma proporção maior de espinhas com formas mais filopodia e é um subtipo imaturo da coluna vertebral.
Espinhos com cabeças definidas, chamadas espinhos de cogumelo, provavelmente contêm sinapses mais desenvolvidas e maduras. Assim, o Neurônio 2 é mais maduro com maior densidade de espinhas maduras. Após a limpeza, os pedaços de tecido podem ser manchados usando a imunohistoquímica tradicional.
